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• Vol. XI, Núm. 3 • Septiembre-Diciembre 2017 •
Ingeniería y Tecnología Artículo arbitrado
Resumen
En este trabajo se compararon tres técnicas de extracción de proteínas
actualmente empleadas en proteómica, para determinar la más eficiente
para realizar electroforesis bidimensional (2-DE) en tejido cerebral y
linfocitos de sangre periférica de rata. Los métodos utilizados fueron el
uso directo de solución de lisis, el método TCA/acetona-DTT y el método
TCA/acetona-fenol. Una vez que se realizó la extracción, se separaron
las proteínas por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y 2-DE, con el objetivo de
seleccionar cuál de ellos brindó un mayor rendimiento en la cantidad de
proteínas totales, así como en el número de bandas bien definidas y
manchas bien enfocadas en los geles 2-DE, tanto para cerebro como para
linfocitos. Al comparar el perfil proteico, en cerebro se detectaron 13 ±
0; 15 ± 1 y 12 ± 1 bandas bien definidas mediante los métodos de TCA/
acetona-DTT, TCA/acetona-fenol y solución de lisis, respectivamente.
En linfocitos, se encontraron 19 ± 1.20 ± 0 y 19 ± 1 bandas,
respectivamente. Con respecto al proteoma, tanto en cerebro como en
linfocitos se encontró mayor número de manchas proteicas consistentes
y bien enfocadas con el método de TCA/acetona-DTT. Estos resultados
mostraron que el mejor método de extracción de proteínas para su uso
en la 2-DE correspondió al de TCA/acetona-DTT, siendo además más
rápido y sencillo de realizar que el método de TCA/acetona-fenol.
Palabras clave: proteómica, electroforesis bidimensional (2-DE),
extracción de proteínas, cerebro, linfocitos.
Abstract
In this work, protein extraction techniques currently used in
proteomics were compared to determine the most efficient to carry
out two-dimensional electrophoresis (2-DE) on brain tissue and
peripheral lymphocytes of rat. The methods used were using lysis
solution, TCA/acetone-DTT method, and TCA/acetone-phenol method.
Once the extraction was performed, proteins were separated by
electrophoresis in polyacrylamide gels under denaturing conditions
(SDS-PAGE) and 2-DE, with the aim of detecting which of them gave a
greater performance in quantity of total proteins as well as the number
of well-defined bands and well-focused spots on 2-DE gels both brain as
lymphocytes. When comparing the protein profile in brain, 13 ± 0;
15 ± 1, and 12 ± 1 bands was detected well-defined in the TCA/acetone-
DTT, TCA/acetone-phenol lysis solution methods, respectively. In
lymphocytes, 19 ± 1, 20 ± 0, and 19 ± 1 bands were found, respectively.
Regarding proteome, both in brain and lymphocytes, a greater number
of consistent and well-focused protein spots were found by TCA/
acetone-DTT method. These results showed that the best method of
protein extraction to use in 2-DE corresponded to the TCA/acetone-
DTT, being faster and easier to perform than the method of TCA/
acetone-phenol.
Keywords: Proteomics, two-dimensional electrophoresis (2-DE),
protein extraction, brain, lymphocytes.
Comparison of protein extraction methods from brain and
lymphocytes of rat
KAREN MALDONADO-MORENO1, ROCÍO MARTELL-GAYTÁN1, BONIFACIO ALVARADO-TENORIO1,
JOSÉ VALERO-GALVÁN1, ALEJANDRO MARTÍNEZ-MARTÍNEZ1, ÁNGEL G. DÍAZ-SÁNCHEZ1
Y RAQUEL GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ1,2
_________________________________
1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ. Bioquímica Funcional y Proteómica del Estrés, Dpto. de Ciencias Químico Biológicas, Instituto de
Ciencias Biomédicas. Anillo del Pronaf y Estocolmo s/n, Zona PRONAF, C.P. 32310, Ciudad Juárez, Chihuahua, México-Tel. 688 1821,
ext. 1622 y 1821.
2 Dirección electrónica del autor de correspondencia: raquel.gonzalez@uacj.mx.
Comparación de métodos de extracción de
proteínas de cerebro y linfocitos de rata
Recibido: Octubre 13, 2017 Aceptado: Enero 5, 2018
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L
Introducción
a proteómica es el estudio comprensivo de la estructura y funciones de las proteínas. Esta
disciplina es más desafiante que la genómica, ya que no solo se basa en una secuencia
lineal de aminoácidos que dan una función, sino que se tiene que determinar la estructura
KAREN MALDONADO-MORENO, ROCÍO MARTELL-GAYTÁN, BONIFACIO ALVARADO-TENORIO, JOSÉ VALERO-GALVÁN, ALEJANDRO MARTÍNEZ-MARTÍNEZ,
ÁNGEL G. DÍAZ-SÁNCHEZ Y RAQUEL GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ: Comparación de métodos de extracción de proteínas de cerebro y linfocitos de rata
terciara de la proteína para identificar su función biológica (Northrop et al., 2008).
Entre los objetivos principales de la proteómica
se encuentra la separación, identificación y
caracterización de proteínas, lo cual permite entender
su interacción con otras proteínas. A pesar de que la
proteómica es una disciplina relativamente nueva, ha
tenido un importante avance en estos últimos años
para integrar técnicas de alto rendimiento y protocolos
que permiten analizar de forma rápida una mayor
cantidad de proteínas. En el análisis proteómico se
emplea un flujo de trabajo (adecuado al tejido que se
analice) en el que se incluyen como pasos principales
el diseño experimental, un muestreo, la preparación
de las muestras, la extracción y separación de
proteínas, análisis por espectrometría de masas (MS),
análisis estadístico, cuantificación y análisis, y
finalmente el manejo y el almacenamiento de datos
(González-Fernández et al., 2014).
La extracción de las proteínas representa un paso
crucial en dicha técnica, siendo de vital importancia
la elección del método de extracción con base al tipo
de muestra de partida. Lo primero a realizar es la
ruptura celular o lisis, donde los métodos más
empleados se basan en la homogenización del tejido y
la destrucción de membranas por medio de procesos
físicos y/o químicos, esto con el fin de maximizar la
liberación de las proteínas y al mismo tiempo evitando
la degradación por factores como la temperatura, o
modificaciones por proteólisis, oxidación, entre otros.
Las técnicas de ruptura celular se pueden clasificar en
métodos físicos mecánicos, métodos físicos no
mecánicos y por métodos químicos, entre los que se
presenta el tratamiento con álcalis, detergentes,
solventes, ácidos o sustancias caotrópicas (González-
Fernández et al., 2014).
Una de las situaciones que se presenta después de
la disrupción celular es la liberación de proteasas que
pueden degradar las proteínas de interés, por lo tanto,
es importante que durante la preparación de la muestra
se evite la actividad proteolítica. Entre las acciones
que se realizan para evitar este proceso se encuentran:
evitar un exceso de ciclos de congelación/
descongelación, agregar soluciones inhibidoras de
proteasa y trabajar rápido, a temperaturas frías
durante el proceso (González-Fernández et al., 2014).
En la proteómica se emplea una amplia variedad
de tecnologías. Entre las más efectivas y ampliamente
usadas encontramos la electroforesis por gel
bidimensional (2-DE) para separar las proteínas y la
MS para su identificación y caracterización. La 2-DE
combina la separación de las proteínas primero por
isoelectroenfoque y después por el peso molecular a
través de un gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes, permitiéndose de esta forma una
mejor separación de las proteínas, que formarán un
mapa bidimensional de manchas proteicas
denominado proteoma, el cual puede ser caracteri-
zado. Este método se puede considerar como un
método de pureza debido al poder de resolución con
el que cuenta, aceptándose que la aparición de una
mancha (o spot) indica una muestra homogénea
(Rabilloud et al., 2010). La 2-DE se ha utilizado
ampliamente en el estudio de muchas patologías como
el cáncer, la diabetes, las enfermedades cardiacas y
los trastornos psiquiátricos a través del análisis
proteómico de los tejidos y fluidos corporales,
incluyendo suero o plasma sanguíneo y tejidos como
el cerebro (Saia-Cereda et al., 2017).
Para realizar estudios de comparación de
proteomas entre cerebro y linfocitos es necesario
utilizar métodos para la extracción de proteínas que
tengan un alto nivel de efectividad y determinar así,
que tan similares o distintos son. Los métodos
usualmente empleados para cerebro y sangre
involucran lavados con ácido tricloroacético (TCA)/
acetona, detergentes en soluciones caotrópicas o
procesos de precipitación, aunque recientemente se
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han reportado protocolos que involucran el uso de
fenol (Cilia et al., 2009). Actualmente, la mayoría de
los estudios de comparación de métodos de extracción
se han realizado en tejidos vegetales (Singh et al., 2017)
o en bacterias (Alam y Ghosh, 2014), pero son escasos
en tejidos como el cerebro (Masuo et al., 2011), o no
hay como en el caso de las células sanguíneas. El
objetivo de este trabajo fue determinar la metodología
más eficiente tanto para la extracción de proteínas de
cerebro como para linfocitos periféricos de rata para
su uso en la 2-DE, ya que, a pesar de que actualmente
hay una gran cantidad de estudios que involucran
estos tejidos, no hay una metodología única y no se
conoce cuál de ellas genera la obtención de un mayor
rendimiento en la cantidad de proteínas total de
proteína y al número de manchas proteicas bien
enfocadas en la 2-DE. Los resultados obtenidos
mostraron que el método con el que se obtuvo una
mejor relación entre el rendimiento de la extracción
de proteína, número de bandas bien definidas
mediante SDS-PAGE y número de manchas proteicas
bien enfocadas mediante 2-DE fue el método de TCA/
acetona-DTT. Esto permitirá futuras investigaciones
con un alto nivel de confiabilidad en estudios
realizados con estos tejidos.
Materiales y métodos
Se utilizaron ratas (Rattus novergicus) hembras
Sprague-Dawley de dos meses de edad de 250-320 g.
Las condiciones de crecimiento fueron de 25 ± 2 °C
de temperatura, ciclos luz/oscuridad de 12/12 h, con
comida y agua ad libitum. Los animales se sacrificaron
por eutanasia inyectando el anestésico pentobarbital
sódico (Pisabental, PiSA®). Este protocolo contó con
la aprobación del comité de bioética del Instituto de
Ciencias Biomédicas de la Universidad Autónoma de
Ciudad Juárez, siguiendo las guías de la Norma Oficial
Mexicana NOM-062-ZOO-1999.
Recolección de las muestras. Las muestras de
sangre se tomaron mediante punción cardiaca, en
tubos Vacutainer™ EDTA. Los linfocitos se aislaron
siguiendo el protocolo desarrollado en nuestro
laboratorio por Vargas-Caraveo et al. (2014). Los
cerebros se extrajeron completos, se almacenaron
a -80 °C, se liofilizaron durante 5 días utilizando un
liofilizador Labconco® mod. FreeZone 6 y se
pulverizaron utilizando un mortero.
Extracción de proteínas. En el cerebro la
extracción se realizó a partir de 30 y 40 mg de peso
seco de cerebro pulverizado para cada método de
extracción. En el caso de los linfocitos, se utilizaron
todos los linfocitos extraídos. Para el método del uso
directo de solución de lisis (adaptado de Pooladi et al.,
2014), se agregó a la muestra solución de lisis (urea 7
M, tiourea 2 M, CHAPS 4% (p/v), tritón X-100 0.5%
(v/v), DTT 20 mM, inhibidor de proteasas 1% (v/
v)). Se sonicó por tres veces durante 10 s, con
descansos de 1 min, manteniendo los tubos en hielo.
Se centrifugó a 16,000 xg durante 10 min a 4 ºC y se
recogió el sobrenadante.
Para el método TCA/acetona-DTT (adaptado de
Deatherage et al., 2015), se agregó a la muestra 600 L
solución fría de 10% (p/v) TCA/ 100% (v/v) acetona,
al 0.07% (p/v) DTT. Se sonicó por tres veces durante
10 s, con descansos de 1 min, manteniendo los tubos
en hielo. Se dejó precipitar las proteínas a -20 °C
durante toda la noche. Al día siguiente, se centrifugó a
16000 xg durante 10 min a 4 °C y se descartó el
sobrenadante. Se realizaron tres lavados con acetona
al 100% fría, que consistieron en un mezclado en
vórtex, una centrifugación a 16000 xg durante 10 min
a 4 °C y la eliminación del sobrenadante. A
continuación, se dejó secar la pella a temperatura
ambiente para eliminar los residuos de acetona.
Finalmente, se solubilizaron las proteínas con la
solución de solubilización mencionada anterior-
mente.
Para el método de TCA/acetona-fenol (adaptado
de González-Fernández et al., 2014), se agregó a la
muestra 600 L solución fría de 10% (p/v) TCA/100%
(v/v) acetona. Se sonicó por tres veces durante 10 s,
con descansos de 1 min, manteniendo los tubos en
hielo. Se centrifugó a 16,000 xg durante 10 min a 4
°C y se descartó el sobrenadante. Se agregó una
solución fría de 0.1 M de acetato de amonio, en 80%
de etanol. Se centrifugó a 16,000 xg durante 10 min a
4 °C y se descartó el sobrenadante. Se agregó de
acetona al 80% (v/v). Se centrifugó a 16,000 xg
durante 10 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante.
Se dejó secar la pella a temperatura ambiente para
eliminar los residuos de acetona. Se agregó tampón
denso SDS (30% (p/v) sacarosa, 2% (p/v) SDS, 5%
(v/v) 2-mercaptoetanol, 0.1 M Tris HCl, pH 8) / fenol
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(1:1), y se dejó incubar durante 5 min. Se centrifugó a
16,000 xg durante 5 min a 4 °C y se pasó la fase de
arriba a un tubo limpio. Se agregó una solución fría de
0.1 M de acetato de amonio, en 100% de etanol. Se
centrifugó a 16,000 xg durante 10 min a 4 °C y se
descartó el sobrenadante. Se agregó una solución fría
de acetona al 80% (v/v). Se dejó secar la pella a
temperatura ambiente para eliminar los residuos de
acetona. Finalmente, se solubilizaron las proteínas con
la solución de solubilización mencionada
anteriormente. Las proteínas se cuantificaron
utilizando reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich®), de
acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Electroforesis en gel de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Se
cargaron 15 mg de proteína en solución tampón de
carga (Tris-HCl 62.5 mM, pH 6.8, SDS 2% (p/v),
glicerol 25% (v/v), azul de bromofenol 0.01%(p/v))
en geles TGX Precast al 12% para el sistema
Criterion® de Bio-Rad® (dimensiones 133 x 87 x 1
mm). Los geles se dejaron correr a 40 mA en solución
tampón de electroforesis (Tris 25 mM, glicina 192 mM,
SDS 0.1% (p/v), pH 8.3) hasta que el frente de elución
llegó al final del gel (Laemmli, 1970).
Electroforesis bidimensional (2-DE). Se realizó
la primera dimensión o isoelectroenfoque (IEF) de
las proteínas, en el sistema PROTEAN IEF Cell
(BioRad), utilizando ReadyStrips IPG Strips (BioRad)
de 11 cm, con gradiente de pH 3-10 no lineal. Las tiras
de IPG se rehidrataron con solución de rehidratación
(urea 7 M, tiourea 2 M, 4% (w/v) CHAPS, 2% (v/v)
anfolitos 3–10, DTT 100 mM, 0.01% (p/v) azul de
bromofenol), conteniendo 50 g de proteína, siguiendo
el protocolo de Bio-Rad. Dicha rehidratación se realizó
de forma activa durante toda la noche a 50 V. Las
condiciones del IEF fueron: 500 V durante 20 min,
gradiente lineal hasta 8,000 V durante 1 hora, 8,000 V
hasta 26,000 V, manteniendo a 1,500 V. Una vez
terminado el IEF, las tiras se conservaron a -20 °C
hasta realizar la segunda dimensión. Antes de la
segunda dimensión, las tiras se equilibraron durante
10 minutos en tampón de equilibrado (Tris-HCl 1.5 M
pH 8.8; urea 6 M; glicerol 20% (p/v); SDS 2% (p/v))
con DTT 2% (p/v) y, a continuación, otros 10 minutos
con tapón de equilibrado con iodoacetamida 2.5%
(p/v) (Görg et al., 2009). utilizando geles TGX Precast
con gradiente de 10-20% de poliacrilamida del
sistema Criterion® de Bio-Rad® (dimensiones 133 x
87 x 1 mm) y se sellaron con agarosa 0.5% (p/v) con
azul de bromofenol en tampón de electroforesis. La
segunda dimensión se llevó a 40 mA constantes hasta
que el azul de bromofenol alcanzó el frente del gel.
Los geles se tiñieron con el método de Coomassie
coloidal con la solución de tinción compuesta por
(NH4)2SO4 60.5 mM, 2.25% (v/v) H3PO4 85%,
metanol 20% (v/v) y azul de Coomassie G250 0.001%
(p/v). Las imágenes se tomaron utilizando un escáner
Epson® XP-420 a una resolución de 400 dpi.
Análisis de imágenes y estadístico. Los geles SDS-
PAGE se analizaron con el programa de análisis de
densitometría de imagen ImageJ (descargado de:
https://imagej.nih.gov/ij/) y los geles 2-DE con el
paquete informático PD Quest 2-D Analysis
Software® (Bio-Rad®), siguiendo las instrucciones
del fabricante. Los datos se expresaron como valor
medio y desviación estándar. Se realizaron pruebas
estadísticas de t-Student, pruebas de medias de Tukey
y ANOVA utilizando el programa SPSS v15.0.
Resultados y discusión
El paso más importante para un análisis
proteómico es la extracción de proteínas de forma
eficiente, es por eso que se realizó este proyecto con
la finalidad de encontrar la metodología que brindara
un mayor rendimiento de proteínas con la mejor
calidad posible. Los métodos más utilizados para
extracción de proteínas de tejido o células de origen
animal utilizan métodos con soluciones de lisis
directamente, con soluciones como cloroformo/
metanol, extracciones con cloruro de litio, con
amortiguadores hipotónicos, con tripsina y
bicarbonato de amonio, entre otros (Shevchenko et
al., 2012; Tiong et al., 2015; Moore et al., 2016). En
este trabajo, se usaron los métodos de extracción con
solución lisis, con solución de TCA/acetona-DTT y
con solución de TCA/acetona-fenol, ya que los dos
últimos no se suelen utilizar en tejidos de origen animal
y brindan mejores resultados en tejidos recalcitrantes
(Wang et al., 2006; Sheoran et al., 2009; Jankowska
et al., 2016).
KAREN MALDONADO-MORENO, ROCÍO MARTELL-GAYTÁN, BONIFACIO ALVARADO-TENORIO, JOSÉ VALERO-GALVÁN, ALEJANDRO MARTÍNEZ-MARTÍNEZ,
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Rendimiento en cantidad de proteínas. Los
métodos que se utilizaron para tratar las muestras
fueron solución lisis, TCA/acetona-fenol y TCA/
acetona-DTT. En las concentraciones obtenidas por
cada uno de los métodos en cerebro y linfocitos, se
observaron diferencias significativas (p < 0.05;
ANOVA y Prueba de Tukey), siendo el de solución lisis
el que obtuvo una mayor concentración de proteína
en el tejido cerebral con 3.10 mg/mL de muestra,
seguido del método de TCA/acetona-DTT y por último
el método de TCA/acetona-fenol (Cuadro 1). En las
concentraciones de proteína obtenidas para linfocitos,
el método que brindó mayor concentración fue el de
TCA/acetona-DTT con 1.56 mg/mL, seguido del
método con solución de lisis y finalmente el de TCA/
acetona-fenol (Cuadro 1).
Cuadro 1. Concentraciones de proteína promedio obtenidas para
cada tejido.
Los datos se presentan como promedio ± desviación estándar
(n = 3). Las literales distintas representan diferencias significativas
entre concentración (p < 0.05; ANOVA y Prueba de Tukey).
En cuanto al rendimiento obtenido para cada uno
de los métodos de extracción de proteínas realizados
en cerebro para los pesos de 30 y 40 mg, se determinó
que el método de solución lisis brindó el mayor
rendimiento, seguido del de TCA/acetona-DTT y, por
último, el de TCA/acetona-fenol, presentando
diferencias significativas entre los métodos (p < 0.05,
prueba de Tukey) (Cuadro 2). Además, se observó un
mayor rendimiento de proteínas en las muestras de
30 mg de cerebro que en las de 40 mg del mismo tejido.
Se esperaría que el rendimiento fuera mayor en la
muestra de 40 mg, sin embargo, sucedió lo contrario
al presentarse un mayor rendimiento en las
metodologías aplicadas a los 30 mg.
Los resultados de la concentración mostrados en
este trabajo (Cuadro 1) concuerdan con los obtenidos
por Gao et al. (2006), donde, al comparar métodos de
extracción en hígado de rata, obtuvieron mayor
concentración con una solución compuesta por urea,
CHAPS, DTT y PMSF, es decir, una composición muy
similar a nuestra solución de lisis. Por otro lado, en un
estudio para la optimización de un método con TCA/
acetona para el análisis de carne en ganado, se
obtuvieron los resultados iguales a los nuestros,
obteniendo mayor concentración con el método de
lisis seguido del método TCA/acetona-DTT (Hao et
al., 2015).
Cuadro 2. Rendimiento promedio de proteínas por método de
extracción en cerebro.
Los datos se presentan como promedio ± desviación estándar
(n = 3). Literales distintas representan diferencias significativas
en el rendimiento de los métodos evaluados (p < 0.05, prueba
de Tukey).
La evaluación de diferentes métodos de
extracción de proteínas para su uso en 2-DE, se suele
realizar con muestras recalcitrantes de plantas,
insectos o bacterias, entre otros. En un estudio donde
se compararon el método de TCA/acetona-DTT,
extracción con fenol y un método con una solución
multi-detergente para obtener proteínas de áfidos, se
obtuvo una mayor concentración por el método de
TCA/acetona-DTT, seguido del de multi-detergente y
por último el método con fenol (Cilia et al., 2009).
Asimismo, en un estudio para seleccionar un método
de solubilización de proteínas para bacterias
fitopatogénicas, se determinó que el método de lisis
brindó una mayor concentración de proteínas en las
bacterias estudiadas que el método con fenol (Malafaia
et al., 2015). Un estudio más reciente realizado en
KAREN MALDONADO-MORENO, ROCÍO MARTELL-GAYTÁN, BONIFACIO ALVARADO-TENORIO, JOSÉ VALERO-GALVÁN, ALEJANDRO MARTÍNEZ-MARTÍNEZ,
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pulpa de dátil y semilla de palma datilera (Phoenix
dactylifera L.), donde utilizaron tres métodos basados
en fenol, TCA/acetona y TCA/acetona-fenol, se
encontró que con el primero se obtuvo un mayor
rendimiento de la extracción de proteínas (Lee et al.,
2017). Sin embargo, en otro estudio realizado en hoja
de Withania somnifera (L.) Dunal en respuesta a la
infección con Alternaria alternata, se presentó el
mejor rendimiento con el método basado en TCA/
acetona (Singh et al., 2017). Como mencionaron
Ericsson et al. (2007), se esperaría que después de la
desintegración del tejido, los fragmentos más
pequeños fueran más efectivos para obtener un
mayor rendimiento en la cantidad de proteína debido
a la relación entre la superficie y el volumen. Por lo
tanto, se podría considerar que no se presentó una
buena desintegración por sonicación del tejido de
cerebro en los 40 mg, pero sí en los 30 mg y, por esto,
se obtuvo un mayor rendimiento en la segunda
cantidad. A pesar de esto, los resultados fueron
similares a los obtenidos por Maldonado et al. (2008)
en hojas de Arabidopsis thaliana al presentar un
mayor rendimiento con el método TCA/acetona-DTT
(1.39 mg/g) que con el método TCA/acetona-fenol
(1.04 mg/g).
Geles SDS-PAGE. El análisis de las bandas
obtenidas por SDS-PAGE mostró que todos los
métodos revelaron bandas proteicas en un rango de
peso molecular desde los 250 kDa hasta los 15 kDa
(Figura 1). En el caso de las proteínas extraídas de
cerebro, se observó que el perfil de bandas proteicas
fue diferente dependiendo el método de extracción,
sobre todo entre los pesos de 37 a 15 kDa (Figura 1A).
Así, se detectaron 13 bandas definidas en el método de
TCA/acetona-DTT, 15 ± 1 bandas en el de TCA/
acetona-fenol y 12 ± 1 bandas para el método de
solución de lisis.
En el caso de las proteínas extraídas de linfocitos,
se encontró mayor número de bandas en un peso
molecular entre 250 kDa y 43 kDa aproximadamente
(Figura 1B). El perfil proteico obtenido para cada
método en este rango de peso molecular fue similar,
encontrándose más diferencias entre los 37 y los 15
kDa. El análisis del número de bandas mostró 19 ± 1
bandas con el método TCA/acetona-DTT, 20 bandas
con el método TCA/acetona-fenol y 19 ± 1 bandas
con el método de lisis.
Figura 1. Perfil proteico de las muestras de cerebro (A) y
linfocitos (B) utilizando el método TCA/acetona-DTT, el método
TCA/acetona-fenol y el método de lisis. kDa: kiloDalton. M:
marcador de peso molecular «Precision Plus Protein™ All Blue
Prestained Protein Standards” de Bio-Rad®. Se cargaron 15
g de proteína en geles TGX Precast al 12% para el sistema
Criterion® de Bio-Rad®. Los geles se corrieron a 40 mA en
tampón de electroforesis y se tiñieron con el método de
Coomassie coloidal.
En el caso de las proteínas extraídas de linfocitos,
se encontró mayor número de bandas en un peso
molecular entre 250 kDa y 43 kDa aproximadamente
(Figura 1B). El perfil proteico obtenido para cada
método en este rango de peso molecular fue similar,
encontrándose más diferencias entre los 37 y los 15
kDa. El análisis del número de bandas mostró 19 ± 1
bandas con el método TCA/acetona-DTT, 20 bandas
con el método TCA/acetona-fenol y 19 ± 1 bandas
con el método de lisis.
En ambos geles obtenidos de la Figura 1 se
presentó una ligera superposición de bandas debido
a la gran cantidad de proteínas presentes en las
muestras y las limitaciones de resolución en este tipo
de geles, siendo el método TCA/acetona-fenol el que
mostró mejor definición de las bandas proteicas. En
un estudio realizado para analizar proteínas de áfidos,
se observó una mejor separación de proteínas por el
método con TCA/acetona-DTT y TCA/acetona-fenol,
mientras que en el método con una solución multi-
detergente no siempre se presentaron las mismas
bandas proteicas ni con la misma concentración (Cilia
et al., 2009). Por otra parte, al comparar con los
estudios realizados por Maldonado et al. (2008), se
concluyó que al trabajar con TCA/acetona-fenol y
TCA/acetona-DTT se permitió la visualización de
bandas de menor intensidad y a la vez aumentó la
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intensidad de las manchas comunes. En estos casos se
observaron proteínas de bajo peso molecular, aunque
con mayor intensidad al utilizar el método de TCA/
acetona-fenol, como se muestra en el gel de la Figura 1.
En un estudio realizado en hígado y bilis de
pescado, se compararon procedimientos donde se
empleaban agentes reductores como el DTT y el 2-
mercaptoetanol, en donde los resultados mostrados
en este trabajo fueron similares al detectarse bandas
definidas en los pesos de 250, 150, 70 y 50 kDa en los
métodos donde se emplean estos dos agentes (TCA/
acetona-DTT y TCA/acetona-fenol), y al igual que en
los geles mostrados en la Figura 1, las diferencias más
notables entre los métodos se encuentran en las
proteínas de bajo peso molecular (de 15 a 10 kDa)
(Tenório-Daussat et al., 2014). Sin embargo, en
estudios realizados en hojas de Ficus deltoidea y en la
pulpa de dátil y semilla de palma datilera, los métodos
que fueron más eficientes en la eliminación de
contaminantes obteniéndose bandas bien resueltas en
un rango más amplio de pesos moleculares mediante
SDS-PAGE fueron los basados en solución de fenol y
en la combinación de TCA/acetona y fenol (Abdullah
et al., 2017; Lee et al., 2017).
Geles 2-DE
Con respecto a cada una de las metodologías de
extracción de proteínas realizadas en cerebro, se
observaron diferencias en el proteoma. Los métodos
de TCA/acetona-DTT y TCA/acetona-fenol
presentaron un mejor enfoque de las manchas
proteicas, esto es, mayor definición de las manchas
(Figura 2A y 2B), que para las proteínas extraídas con
solución de lisis (Figura 2C). El método TCA/acetona-
DTT presentó una mejor resolución de la separación
de las proteínas a lo largo del gel, con un mayor
número de manchas proteicas entre los pesos de 75 a
37 kDa a pI por debajo de 7 (Figura 2A).
En el caso del gel correspondiente al método de
TCA/acetona-fenol no se observó la misma mancha
proteica de mayor intesidad que se presentó en los
geles con los otros dos métodos de extracción (Figura
2B). Para el caso de la extracción con solución de lisis
se observó esta misma mancha de mayor intensidad,
estando menos enfocada que la misma mancha en el
gel correspondiente al método TCA/acetona-DTT
(Figura 2C). En el caso de los linfocitos, solo se realizó
la 2-DE para los métodos de extracción de proteína
con el método TCA/acetona-DTT (Figura 2D) y con
el método de solución con solución de lisis (Figura
2E), debido al menor rendimiento de proteína
obtenido con el método de TCA/acetona-fenol, siendo
el primer método con el que se obtuvo el mejor
enfoque de las especies proteicas.
El análisis del número de manchas proteicas
totales realizado mediante el programa de análisis PD-
Quest 2D de Bio-Rad® no mostró diferencias
significativas entre los tres métodos, ni en cerebro ni
en linfocitos (p<0.05; ANOVA t-Student,
respectivamente), aunque el método TCA/acetona-
DTT mostró una mayor cantidad de manchas y más
definidas, seguida por el método TCA/acetona-fenol
y por el método con solución de lisis (Cuadro 3). Al
comparar manchas proteicas entre metodologías, en
cerebro se encontró mayor número de manchas
proteicas consistentes en el método de TCA/acetona-
DTT, seguido del de TCA/acetona-fenol y solución lisis.
En el caso de los linfocitos, fue mediante el método de
TCA/acetona-DTT.
Una explicación para la similitud de nuestros
resultados con otros estudios se podría determinar por
medio de los componentes usados en cada uno de ellos.
En el método de solución de lisis se utilizan agentes
caotrópicos como la urea y tiourea los cuales
desnaturalizan las proteínas a través de la disrupción
de enlaces no covalentes y iónicos entre los residuos
de aminoácidos (Glatter et al., 2015). El uso de
soluciones solo con urea no se recomienda, ya que
tiende a una degradación espontánea a cianato; sin
embargo, su combinación con tiourea, en el caso
específico del IEF, mejora la solubilización de
proteínas de membrana debido a que la tiourea rompe
las interacciones hidrofóbicas (Kim y Kim, 2007).
Además, la utilización únicamente de agentes
caotrópicos no es suficiente a la hora de la extracción
de proteínas, ya que no disuelven los lípidos
eficientemente y no son capaces de mantener solubles
a las proteínas por sí solas bajo las condiciones gel
IEF (Rabilloud et al., 2011). Es por eso que para
alcanzar estas características se utilizan los
detergentes como CHAPS, Tritón X-100 y agentes
reductores como DTT, debido a que previenen las
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Figura 2. Geles 2-DE representativos obtenidos para cerebro, con el método TCA/acetona-DTT (A), el método TCA/acetona-fenol (B)
y el método de lisis (C), y para linfocitos con el método TCA/acetona-DTT (D) y el método de lisis (E). MW: marcador de peso
molecular «Precision Plus Protein™ All Blue Prestained Protein Standards» de Bio-Rad®. kDa: kiloDalton. Se cargaron 50 μg de
proteína, la primera dimensión se realizó con tiras ReadyStrips IPG de 11 cm, con gradiente de pH 3 a 10 no lineal de Bio-Rad® y
la segunda dimensión con geles TGX Precast de 10-20% de poliacrilamida de Bio-Rad®. Los geles se corrieron a 40 mA en tampón
de electroforesis y se tiñieron por el método de Coomassie coloidal.
interacciones hidrofóbicas, solubilizan las proteínas
de membrana y promueven la reoxidación de puentes
disulfuro, respectivamente (Chevalier, 2010; Malafaia
et al., 2015). El uso de Tritón X-100 en el estudio de
Shevchenko et al. (2012) fue uno de los tres
protocolos que presentó mayor número de bandas
proteicas en un gel SDS-PAGE y el que brindó un mayor
rendimiento en extracción de proteínas. Si bien, el uso
de CHAPS solo con urea es superior a Tritón X-100,
cuando se emplea la combinación urea-tiourea, el uso
de Tritón X-100 se vuelve más eficiente para la
solubilización de proteínas que con CHAPS (Rabilloud
et al., 2008).
Figura 3. Diagrama de Venn con el número de manchas proteicas
consistentes comunes y únicas entre métodos, en cerebro (A)
y linfocitos (B), obtenidas en el análisis 2-DE.
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Cuadro 3. Número de manchas proteicas totales para cerebro y
linfocitos obtenido en el análisis de los geles 2-DE para cada
método de extracción.
Los datos se presentan como promedio ± desviación estándar (n = 3).
Como se ha mencionado, en estudios anteriores
el uso de TCA/acetona se ha utilizado con éxito en
una amplia variedad de muestras biológicas para
eliminar los componentes no proteicos que pueden
interferir en los geles (Wang et al., 2006; Cilia et al.,
2009; Alam y Gosh, 2014; Haudenschild et al., 2014).
La combinación de TCA con acetona se usa común-
mente para la precipitación de proteínas y eliminar
contaminantes y sales durante la preparación de las
muestras para la 2-DE, que pueden competir con la
migración de proteínas en el IEF (Feist y Hummon,
2015). En un estudio previo realizado en diferentes
partes del cerebro de rata, donde se compararon
diferentes métodos de precipitación y solubilización
de proteínas, el método basado en una solución solo
con TCA y una sonicación posterior dio como resultado
una buena separación de proteínas y el mayor
número de manchas proteicas en la 2-DE (Fic et al.,
2010). Igualmente, Masuo et al. (2011) encontraron
una buena resolución de bandas en la SDS-PAGE y
manchas proteicas en la 2-DE, en cerebro completo y
en diversas regiones del mismo, utilizando el método
TCA/acetona con 2-mercaptoetanol en lugar de DTT
como agente reductor. Por tanto, el uso de estos
componentes brindó una ventaja sobre el método con
solución de lisis que utiliza solo el detergente SDS, ya
que en este estudio se encontró que el método TCA/
acetona-DTT incluyendo una etapa de sonicación fue
el que tuvo una mayor cantidad de manchas proteicas
y mejor enfocadas tanto para cerebro como para
linfocitos (Figura 2, Cuadro 3, Figura 4). El método
TCA/acetona-DTT también fue el protocolo que
obtuvo mayor número de manchas proteicas a lo largo
de todo el gradiente de pI y peso molecular en el
proteoma de la infección de W. somnifera causada por
A. alternata en comparación con el método basado
en fenol (Singh et al., 2017).
En el caso del método de TCA/acetona-fenol se
utilizan otros reactivos aparte de los ya mencionados
con anterioridad; por ejemplo, el acetato de amonio
en combinación con metanol permite neutralizar el
TCA residual e incrementar el pH > 7, facilitando la
subsecuente extracción de proteínas con fenol (Wang
et al., 2006), además de ayudar a la remoción de
polisacáridos de bajo peso molecular (Kim y Kim,
2007). El fenol minimiza también la degradación de
las proteínas debido a la actividad proteolítica
endógena (Zheng et al., 2007). A pesar de que se ha
encontrado que el método de TCA/acetona-fenol
brinda un mayor rendimiento de proteínas para
ciertos tejidos vegetales y bacterianos (Sheoran et al.,
2009), en el caso del cerebro y de linfocitos de rata no
sucedió así, siendo el segundo método en número total
de manchas consistentes bien enfocadas (Figura 2,
Cuadro 3, Figura 4). A pesar de esto, entre el método
de TCA/acetona-DTT y TCA/acetona-fenol se obtuvo
el mayor número de manchas proteicas consistentes
comunes entre ambas metodologías (Figura 4).
Por tanto, aunque el método de lisis sea uno de
los más utilizado en tejidos y/o células de origen
animal y el método de TCA/acetona-fenol en tejidos
vegetales o microorganismos para la extracción de
proteínas para la 2-DE, el uso del método de TCA/
acetona-DTT mejora la resolución con respecto al de
lisis y conlleva un ahorro en tiempo y dinero con
respecto al de TCA/acetona-fenol al constar de un
número menor de pasos y requerir menos cantidad
de reactivos.
Conclusiones
Se logró comparar los métodos de extracción de
proteínas en cerebro y linfocitos de sangre periférica
de rata. A pesar de no presentarse diferencia
significativa entre las metodologías analizadas, el
método de TCA/acetona-DTT resultó más adecuado
para la extracción de proteínas en estos tejidos, ya
que generó un mayor número de manchas proteicas
y con una mayor calidad (mejor enfoque proteico y
resolución en la 2-DE). Además, el método TCA/
acetona-DTT es más rápido y sencillo de realizar en
comparación del método de TCA/acetona-fenol y
generó un mayor rendimiento en la cantidad de
proteínas que el método de lisis.
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Agradecimientos
Este proyecto fue financiado con fondos del
proyecto de Apoyo a Nuevos PTC de Prodep
(convenio DSA/103.5/15/7004, UACJ-PTC-326) y
con infraestructura y fondos propios de la UACJ. KMM
fue beneficiaria de una beca para estudiante de
Prodep.
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