Ingeniería y Tecnología  
Artículo arbitrado  
Método para la extracción de ADN  
cloroplastídico de Bouteloua gracilis como  
herramienta para aplicaciones moleculares  
Method of chloroplast DNA extraction from Bouteloua  
gracilis as a tool for molecular applications  
1
1
1
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA , SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS , DAVID A. BETANCOURT-GUERRA ,  
2
1
1
ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ , TANIA SIQUEIROS-CENDÓN , BLANCA RIVERA-CHAVIRA ,  
1
1,3  
GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ  
Recibido: Mayo 10, 2011  
Aceptado: Octubre 24, 2011  
Resumen  
Abstract  
Genetic manipulation of the chloroplast genome is at the forefront  
of biotechnology research. B. gracilis is a model for the study  
of water stress and oxidative capacities related to the  
chloroplast. It is requires a method to facilitate the obtaining of  
good quality DNA, particularly when it comes to chloroplast  
DNA of B. gracilis. The implementation of a method for extracting  
cpDNA was achieved by assaying different strategies cpDNA  
extraction reported in the literature and combining the most  
appropriate stage for B. gracilis for cpDNA extraction. The  
incorporation of an additional step of washing with CTAB after  
lysis of chloroplasts, allowed the recovery of enriched cpDNA  
which can be used in the development of molecular tools. Due  
to the implementation of an extraction protocol was also possible  
to obtain a considerable amount of B. gracilis cpDNA. The cpDNA  
was digested with several restriction enzymes and the resulting  
fragments were analyzed by Southern blot with probes of genes  
La manipulación genética del genoma de cloroplasto esta a la  
vanguardia en investigación biotecnológica. El pasto B. gracilis es  
un modelo para el estudio de estrés hídrico y oxidativo, capacidades  
relacionadas al cloroplasto. Es necesario tener un método que facilite  
la obtención de ADN de buena calidad, particularmente cuando se  
refiere al ADN de cloroplasto de B. gracilis. La implementación de  
un método para la extracción de cpADN se logró probando diferentes  
estrategias de extracción de cpADN reportados en la literatura y  
combinando las etapas más apropiadas para B. gracilis. La  
incorporación de un paso adicional del lavado con CTAB permitió la  
recuperación de cpDNA enriquecido, el cual se puede utilizar en el  
desarrollo de hermanitas moleculares. Debido la implementación de  
un protocolo de extracción también fue posible obtener una cantidad  
considerable de cpADN de B. gracilis. El cpADN fue digerido con  
varias enzimas de restricción y los fragmentos resultantes fueron  
analizados por Southern blot con las sondas de los genes de rADN  
16S and 23S rDNA. The method developed allowed us to obtain  
16S y 23S. Con base en los perfiles de restricción, en este trabajo  
a considerable amount of cpDNA of B. gracilis which can be  
cut with restriction enzymes and used for genetic mapping.  
These results allow us in future work for the genetic manipulation  
of the chloroplast genome.  
se reporta un mapa parcial de restricción del genoma del cloroplasto  
de B. gracilis y se plantea que la metodología aquí establecida en un  
futuro permitirá abordar la manipulación genética del genoma de  
cloroplasto.  
Palabras clave: Análisis molecular, clonación de genes, mapa Keywords: Molecular analysis, gene cloning, gene mapping,  
genético, transferencia horizontal de genes.  
horizontal gene transfer  
.
Introducción  
as células de las plantas verdes y algunos protistas contienen organelos llamados  
cloroplastos; estos organelos pueden convertir la luz en energía química utilizable por el  
organismo (Blaustein et al., 1998). Los cloroplastos son organelos intracelulares que  
L
contienen la maquinaria necesaria para los procesos involucrados en la fotosíntesis. Estos  
participan en la biosíntesis de aminoácidos, nucleótidos, lípidos y carbohidratos (Sugiura, 1992).  
_
1
________________________________  
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Chihuahua. Campus Universitario II. Apdo. Postal 1542-C. Chihuahua,  
Chih., México. 31125. Tel. (614) 236-6000.  
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Carretera Celaya-San Miguel de Allende S/N CP.30110.  
Celaya, Gto. México.  
2
3
Dirección electrónica del autor de correspondencia: qrascon@uach.mx.  
1
32  
• Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
Al igual que las mitocondrias, el estroma  
de un cloroplasto alberga pequeñas moléculas  
de ADN circular de doble cadena y ribosomas  
similares a las procariotas. El estudio de esta  
molécula promete ser una alternativa para el  
desarrollo biotecnológico de gramíneas de  
importancia en campos como la ganadería y  
la agricultura, además de ser una herramienta  
útil en el estudio de las características  
fisiológicas relacionadas con el cloroplasto. En  
La línea de investigación está enfocada al  
estudio del cpADN de B. gracilis (navajita azul),  
el cual es un pasto forrajero presente en amplias  
regiones del continente (García-Sánchez y  
Monroy-Ata, 2005) y posee importantes  
características relacionadas a la resistencia al  
estrés hídrico. El interés del grupo de  
investigación es desarrollar metodologías  
moleculares para el análisis de la organización  
de los genes cloroplastídicos debido a dos  
características importantes de este organelo y  
su ADN: uno, participa bioquímica y  
molecularmente en el desarrollo y adaptación  
de la planta al medio ambiente y dos, los  
caracteres codificados en el genoma  
cloroplastídico sólo se segregan vía materna.  
1
963 se comprobó que los cloroplastos  
contenían su propio ADN (Sager e Ishida,  
963); el ADN del cloroplasto (cpADN) es un  
1
remanente de genomas de un simbionte  
bacteriano ancestral. Dependiendo del  
organismo, el cloroplasto contiene de 60 a 200  
genes que participan en la expresión génica  
El primer paso para realizar investigación  
relacionada conADN de cloroplasto fue elaborar  
una estrategia que permitiera obtener fracciones  
enriquecidas de cpADN de buena calidad y en  
cantidad suficiente para llevar a cabo los  
experimentos necesarios dentro del laboratorio.  
Se han desarrollado varios métodos para la  
extracción de cpADN, la mayoría de los métodos  
contienen tres etapas principales: 1) La  
separación de los cloroplastos de otros  
organelos, 2) La lisis de los cloroplastos y 3) La  
purificación del cpADN (Jansen et al., 2005).  
Algunos métodos utilizan gradientes de sacarosa  
(
Leister, 2003). El tamaño de la molécula de  
ADN cloroplastídico puede variar, dependiendo  
de la especie, entre 120 y 170 Kb (Palmer,  
1
987). En los años 80 surgió la idea de realizar  
ingeniería genética dentro del cloroplasto  
Daniell et al., 2002), desde entonces, el  
(
estudio del cpADN de diferentes especies se  
ha perfilado como uno de los objetivos de la  
manipulación genética (Bogorad, 2000). Ya se  
ha logrado insertar genes heterólogos en el  
genoma de cloroplasto; se han expresado  
antígenos para la elaboración de vacunas  
dentro de este organelo (Chebolu y Daniell,  
(
Palmer, 1987), soluciones con altas  
2
007; Tregoning et al., 2003), así como  
proteínas de interés farmacéutico como el IGF-  
(Ruiz, 2002). La modificación genética dentro  
concentración de NaCl (Bookjans et al., 1984) y  
tratamiento con DNAsa 1 (Kolodner y Tewari,  
1
1979). Nuestro grupo de investigación, utilizando  
del cloroplasto tiene ventajas cuando se  
compara con la modificación de ADN nuclear,  
debido a que las condiciones internas del  
cloroplasto presentan menos mecanismos de  
regulación debido a su carácter procariótico  
un método salino sin DNAsa, logró extraer  
suficienteADN para hacer análisis molecular; sin  
embargo, es un método que no resultó eficiente  
y simple para la recuperación de ADN de  
cloroplasto enriquecido (Aguado et al., 2011). Se  
ha reportado que la extracción de cpADN en  
plantas pertenecientes a la familia Poaceae es  
difícil de realizar debido a las características  
fisiológicas de las plantas por su alto contenido  
de lignina y polisacáridos (Diekmann et al., 2008),  
y en algunos casos ha sido necesaria la adición  
de etapas de purificación del ADN durante la  
extracción del cpADN (Virupakshi y Naik, 2007).  
(
Koya y Daniell, 2005). Además, la  
característica de mayor interés del cloroplasto  
es la manera como se transfiere a su  
descendencia preferentemente vía materna, lo  
que hace a este organelo un contenedor de  
genes con capacidad para evitar la liberación  
de polen transgénico (Scotty Wilkinson, 1999),  
es decir, evitar la transferencia horizontal de  
genes.  
1
33  
•
Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
En el presente trabajo se desarrolló un  
método de extracción donde, el primer objetivo  
fue mejorar el rendimiento para la obtención de  
cpADN; el segundo objetivo fue recuperar  
cpADN con una pureza tal que fuera posible  
realizar un patrón de digestión y mapa genético  
parcial de un segmento del cpADN de Bouteloua  
gracilis, como herramienta molecular.  
NaCl (10% CTAB, 0.7 M NaCl); se incubó durante  
15 min a 65ºC, posteriormente se agregó un  
volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico  
(25:24:1) y se agitó durante 5 min, los tubos se  
centrifugaron por 10 min a 12,000 rpm a  
temperatura ambiente, se descartó la fase  
fenólica y la fase acuosa se transfirió a un tubo  
limpio. A la fase acuosa se le agregó 1 volumen  
de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se agitó  
durante 5 min, el tubo se centrifugó a 12,000 rpm  
por 10 min a temperatura ambiente. Se recuperó  
la fase acuosa, se transfirió a un tubo limpio y se  
agregó 1/10 de volumen de acetato de amonio 5  
M y 1 volumen de isopropanol, La mezcla se  
incubó toda la noche a -20 ºC. Al siguiente día,  
las muestras se centrifugaron a 12,000 rpm  
durante 15 min a 4 ºC; se descartó el  
sobrenadante y al precipitado se le agregó un  
volumen de etanol al 7%; se centrifugó en las  
condiciones anteriores. Se decantó el etanol y a  
la pastilla resultante se le agregó un volumen de  
etanol absoluto y se centrifugó a 14,000 rpm  
durante 5 min a 4ºC. Se descartó el etanol, la  
pastilla se secó a temperatura ambiente y  
posteriormente se resuspendió en 10 ml de agua  
destilada estéril. Para la cuantificación del ADN,  
se realizó una dilución 1:100 con agua destilada  
estéril. La dilución se analizó a 260 y 280 nm en  
un espectrofotómetro (SmartSpec 3000,  
BioRad).  
Materiales y métodos  
ExtracciónADN cloroplastídico de Bouteloua  
gracilis. Se colocaron 40 gramos de células  
clorofílicas (c.c.) con 180 ml de buffer de  
extracción (1.25 M NaCl, 50 mMTris-HCl pH 8.0,  
5
mM EDTA, 0.1% BSA, 0.1% -mercaptoetanol).  
La mezcla se licuó por 2 min (en un vaso  
previamente enfriado), en lapsos de 30 s cada  
vez. El homogenizado fue filtrado a través de  
ocho capas de gasa y recuperado en un  
recipiente estéril y frio. El filtrado fue centrifugado  
a 1,000 rpm por 20 min a 4ºC, trasladando el  
sobrenadante a un recipiente limpio y  
descartando la pastilla, la cual contenía restos  
celulares y células no lisadas. El sobrenadante  
fue centrifugado a 4,500 rpm por 20 min a 4ºC  
con el fin de empaquetar los cloroplastos (pastilla  
enriquecida con cloroplastos), dejando en la  
suspensión las mitocondrias. Con cuidado, la  
pastilla se resuspendió con 5 ml de buffer de  
lavado frío (0.35 M Sorbitol, 50 mM Tris-HCl, pH  
8
.0, 25 mM EDTA) para no lisar los cloroplastos.  
Marcaje de sondas de las sondas 16S y  
23S ribosomales con digoxigenina. Las sondas  
se marcaron mediante la Reacción en Cadena  
de la Polimerasa incorporando dUTP-  
digoxigenina en los fragmentos de los genes de  
interés (Hoisington et al., 1994) e iniciadores  
específicos para cada sonda. La reacción  
(volumen final 50 ml) contuvo 1X Taq Buffer, 50  
Después, se agregaron 50 ml de buffer de lavado  
y se centrifugó a 4,500 rpm por 20 min a 4 ºC. La  
pastilla se resuspendió con una pipeta de boca  
ancha en 1 ml de amortiguador de resuspensión  
frío (100 mMTris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 100  
mM NaCl, 0.2% b-mercaptoetanol) y se transfirió  
a tubos de 1.5 ml, repartiendo en volúmenes  
iguales (650 ml). A los tubos se les agregó 60 ml  
de SDS al 10%, y se mezcló; los tubos se  
calentaron a 60 ºC en baño María por 5 min.  
Después de la lisis, a los tubos se les agregó 3  
ml de RNAsa (10 mg/ml), 5 ml de proteinasa K  
mM MgCl , 10 mM dNTP’s, 2.4 nM dTTP-Dig, 2  
2
ìM Forward y Reverse Oligonucleótido, 2 U de  
Taq polimerasa y 10 ng de ADN). Las  
condiciones de amplificación fueron: 95 °C/ 3  
min desnaturalización inicial, 95 °C/30 s  
desnaturalización, 60 °C/40 s alineamiento, 72 °C  
/40 s extensión, durante 35 ciclos y una xtensión  
final de 10 min a 72 °C.  
(
10 mg/ml) y 30 ml de SDS al 10%, esta solución  
se incubó durante 25 min a 37ºC; se agregaron  
00 ml de 5 M NaCl y 80 ml de solución CTAB/  
1
1
34  
• Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
Detección de genes por hibridación tipo  
Southern blot. Las muestras de cpADN  
sometidas a digestión con enzimas de  
restricción, fueron separadas electroforética-  
mente en geles de agarosa y antes de la  
transferencia el gel fue depurinado con 100 mM  
HC por 30 min y luego desnaturalizado con 1.5  
M NaCl y 200 mM NaOH durante 30 min. La  
transferencia del ADN a membranas de nylon  
se realizó de acuerdo con lo reportado por  
Southern (1975). Se realizó una pre-hibridación  
e hibridación en tubos de vidrio dentro de un  
horno a 65 ºC con solución HYB (5 X SSC, 0.1%  
Laurilsarcosina, 0.2% SDS, 1% Reactivo de  
bloqueo) suplementado con 1 ng/ml de sonda  
marcada con digoxigenina específica para cada  
gen, siguiendo las instrucciones descritas por  
Hoisinton et al. (1994). La detección  
inmunológica y el revelado quimioluminiscente  
(Virupakshi y Naik, 2007). Este tratamiento  
permitió obtener una pastilla de cpADN con la  
calidad suficiente para ser tratada con diferentes  
enzimas de restricción.  
Como material inicial se utilizaron 40 g de  
células clorofílicas de B. gracilis y 25 g de  
acelga (Beta vulgaris) esta última como control  
de extracción. Se obtuvo un mayor rendimiento  
en la cantidad de cpADN obtenida en B. vulgaris  
debido a su alto contenido de cloroplastos; el  
rendimiento para las células clorofílicas (c.c.)  
de B. gracilis aumentó (Cuadro 1), en  
comparación al rendimiento promedio obtenido  
en la misma especie al utilizar el método salino  
(Bookjans et al., 1984). Cuatro mg de cpADN  
de B. vulgaris y de c.c. de B. gracilis se  
digirieron con EcoRI, el producto obtenido fue  
separado mediante electroforesis en un gel de  
agarosa (Figura 1); con la finalidad de observar  
la integridad del cpADN.  
(CSPD-Star) se llevó a cabo de acuerdo a lo  
reportado por Kessler et al. (1990).  
Cuadro 1. Concentraciones de cpDNA obtenidas a partir de  
células clorofílicas de B. gracilis y B. vulgaris con el método  
salino modificado con CTAB.  
Resultados y discusión  
Implementación de la extracción de cpDNA.  
El método desarrollado consiste en varias etapas  
de fácil realización, como la molienda, eliminación  
de contaminantes de elevado peso molecular y  
la separación de los cloroplastos mediante  
centrifugación; también contiene soluciones  
diseñadas para la disolución de ADN nuclear  
contaminante (Bookjans et al., 1984; Triobush et  
al., 1998; Virupakshi y Naik, 2007). Contiene una  
etapa de purificación de ácidos nucleicos  
haciendo uso de la estructura molecular y de las  
características fisicoquímicas del detergente  
Bromuro Cetiltrimetilamonio (CTAB). En este  
método, el punto clave para la obtención de  
cpADN puro e íntegro es la extracción con el  
detergente CTAB, esto se debe a que este  
detergente se adhiere a estructuras con  
características fisicoquímicas similares a los  
sacáridos, polisacáridos y polifenoles; en bajas  
concentraciones iónicas, el detergente se une a  
la estructura de los sacáridos de los ácidos  
nucleicos; al elevar la polaridad del medio en el  
que se encuentra el CTAB debilita su adhesión  
Concentración  
ng/l)  
Abs  
260/280 nm  
Total  
(g)  
Rendimiento  
(g/g)  
Material inicial  
(
C.c. de B. gracilis  
2.6  
2.8  
1.89  
1.85  
104  
140  
2.6  
5.6  
B. vulgaris  
Figura 1. Separación electroforética de la digestión de cpDNA  
de c.c. de B. gracilis y B. vulgaris. Carril 1, marcador l-HindIII;  
carril 2 cpDNA de B. vulgaris con EcoRI; carril 3, cpDNA B.  
vulgaris sin cortar; carril 4cpDNA de c.c. de B. gracilis con  
EcoRI; carril 5, cpDNA de c.c. de B. gracilis sin cortar.  
1
35  
•
Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
Figura 2. Separación electroforética de la digestión cpDNA de  
c.c. de B. gracilis. Carril 1, MPMl-HindIII; carril 2, cpDNA c.c.  
de B. gracilis sin digerir; carril 3, cpDNA c.c. de B. gracilis  
En la Figura 1 se observó un patrón de  
digestión para ambas especies en los carriles 2  
y 4 (B. gracilis y B. vulgaris). Es posible observar  
en los carriles 3 y 5 una banda de ADN de alto  
peso molecular que corresponde al cpADN no  
cortado. En la parte inferior de los carriles se  
observó una cantidad considerable deARN. Los  
resultados de la pureza y digestión del ADN son  
similares a lo reportado por Bookjans et al. (1984)  
y por Triobush (1998).  
con EcoRI; carril 4, cpDNA c.c. de B. gracilis con HindIII; carril  
5, cpDNA c.c. de B. gracilis con BamHI.  
La adición de RNAsa antes de la lisis  
cloroplastídica elimina la presencia de ARN, por  
lo que la cuantificación se atribuye a la presencia  
de cpADN. En el análisis espectrofotométrico se  
observó una relación en la absorbancia 260/280  
cercana al 2.0, esto indica que la pureza del  
cpADN es buena (Cuadro 2) y que la absorbancia  
es debida preferentemente a la presencia de  
cpADN y no a ARN (Figura 2). Si bien el  
rendimiento en mg/g fue inferior, se mantuvo la  
cantidad de cpADN recuperado (Cuadro 2).  
Cuadro 2. Concentraciones de cpDNA obtenidas a partir de  
c.c. de B. gracilis con el método salino modificado con CTAB  
mas RNAsa.  
Concentración  
ng/l)  
Abs  
260/280 nm  
Total  
(g)  
Rendimiento  
(g/g)  
Material inicial  
(
Se puede observar que el tratamiento con  
C.c. de B. gracilis 1  
C.c. de B. gracilis 2  
3.345  
3.590  
1.98  
1.99  
133  
144  
3.325  
3.6  
CTAB después de la lisis cloroplastídica  
permite separar al cpADN de contaminantes  
que en ocasiones inhiben la acción de las  
enzimas de restricción. El CTAB permite  
separar a las ribosas de los ácidos nucleicos  
contaminantes, ya que estos tienen una  
estructura similar, que se adhieren a estos  
azúcares, como lo son los polisacáridos y  
polifenoles (Virupakshi y Nail, 2007). Existen  
por tanto compuestos contaminantes de  
características fisicoquímicas similares a las  
del ADN que son extraídas de manera  
simultánea.  
El cpADN obtenido a partir de B. gracilis fue  
cortado con diferentes enzimas de restricción.  
En la Figura 2 es posible observar que se  
presentó un patrón de digestión claro para las  
tres enzimas utilizadas (EcoRI, BamHI, HindIII).  
En la Figura 2 se observó también menor  
cantidad de RNA comparado con la Figura 1  
debido al uso de RNAsa. Se observó que con  
este método la banda de cpADN de B. vulgaris  
y de c.c. de B. gracilis (Figura 1) fue semejante  
en intensidad e integridad, por lo que se puede  
inferir que el tratamiento con el detergente CTAB  
no afectó la integridad deADN y permitió obtener  
cantidades similares deADN, en detrimento del  
rendimiento.  
Para mostrar el potencial uso de este  
método como herramienta para el análisis  
molecular, se realizó un mapa parcial de  
segmentos ribosomales del cpADN.  
1
36  
• Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
Figura 3. Hibridación tipo Southern blot del cpDNA de B. gracillis  
cortado con diferentes enzimas. A. Hibridación con sonda  
Mapa de los genes de rADN 16S y 23S  
1
6S. Carril 1, MPM HindIII-Dig; carril 2, cpDNA B. gracilis con  
en el genoma cloroplastídico de B. gracilis.  
Para la identificación del gen de rADN16S y  
EcoRI; carril 3, cpDNA B. gracilis con EcoRI y BamHI; carril 4,  
cpDNA B. gracilis con BamHI; carril 5, cpDNA Z. mays con  
HpaI. B. Hibridación con sonda 23S. Carril 1, MPM HindIII-Dig;  
carril 2, B. gracilis con EcoRI; carril 3, B. gracilis con BamHI;  
carril 4, B. gracilis con HindIII; carril 5, Z. mays con HpaI.  
2
3S en el cpADN de B. gracilis, el cpADN se  
sometió a restricción con diferentes enzimas;  
los productos digeridos fueron separados  
electroforéticamente y transferidos a  
membranas de nylon; posteriormente  
mediante Southern blot con las ondas  
ribosomales 16S y 23S los genes arriba  
referidos fueron identificados en la membrana  
conteniendo el DNA digerido. En la Figura 3 A,  
se observa la hibridación de la sonda 16S  
ribosomal con fragmentos de 16000, 3300,  
3
300 y 12300 resultantes de la restricción con  
las enzimas EcoRI, EcoRI/BamHI, BamHI y  
HpaI, respectivamente. El gen ribosomal 23S  
mostró un perfil de hibridación distintivo, con  
fragmentos tanto de alto peso molecular como  
de bajo peso molecular (Figura 3B).  
Debido a la conservación de los genomas de  
los cloroplastos en plantas, se consideró que el  
genoma de maíz puede servir como referencia.  
Esto se confirmó utilizando la base de datos de  
GeneBank y los genomas reputados de cpDNA de  
maíz (accesión AY928077) y B. gracilis (accesión  
EU282003) analizados utilizado la herramienta de  
Clustal X 2.0 (resultados no mostrados). La similitud  
entre los resultados esperados permitió asumir que  
los sitios de corte en B. gracilis se encuentran  
posicionados justo donde se espera que estén  
localizados los sitios en maíz, con excepción del  
sitio de corte para la enzima BamHI que está  
ubicado en diferente posición, quizá sea la única  
diferencia entre estos dos segmentos (Figura 4).  
La hibridación con el 23S ribosomal (Figura  
3
B) muestra fragmentos de 15058, 3452,  
(
8841, 890) y 11547 pb con las enzimas EcoRI,  
BamHI, HindIII y HpaI, respectivamente. En los  
carriles 5 de la Figura 3 Ay B se corrió ADN de  
cpDNA de maíz como referencia debido a que  
el maíz y el zacate B. gracilis pertenecen a la  
misma familia. La combinación de estos datos  
de hibridación permitió elaborar un mapa  
parcial de restricción (Figura 4).  
Figura 4. Mapa parcial de restricción de un repetido invertido del cpDNA de Bouteloua gracilis y Zea mays. El mapa comprende la  
secuencia presente entre los nucleótidos 90741 y 105618 del cpDNA de maíz, la diferencia encontrada en el sitio de restricción  
para la enzima BamHI se muestra en un recuadro negro.  
1
37  
•
Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
GARCÍA-SÁNCHEZ, R., y A. Monroy-Ata. 2005. Micrositios del pasto  
Conclusiones  
navajita (Bouteloua gracilis) en comunidades de pastizal y  
de matorral del altiplano mexicano. Revista Especializada en  
Ciencias Químico-Biológicas. 8: 61-70.  
En el método desarrollado se implementaron  
etapas de separación de los organelos basados  
en los métodos salinos reportados por Triobush  
en 1998 y por Bookjans en 1984 utilizando NaCl  
con la finalidad de eliminar ADN nuclear que  
pudiera estar adherido a las membranas  
cloroplastídicas. El paso incorporado es una  
etapa de purificación del cpADN con el detergente  
CTAB después de la lisis cloroplastídica, con el  
fin de eliminar contaminantes que se encuentran  
adheridos a los esqueletos de fosfato del cpDNA.  
El uso de RNAsa tiene un efecto positivo en la  
cantidad y calidad de cpDNA extraído en este  
método. La elaboración de un mapa parcial de  
restricción permite asumir que el método de  
extracción se puede utilizar para el desarrollo de  
herramientas moleculares y para el análisis el  
genoma cloroplastídico.  
HOISINGTON, D., M. Khairallah, and D. González-De León. 1994.  
Laboratory protocols: CIMMYT Applied Molecular Genetics  
Laboratory. CIMMYT. pp 70.  
JANSEN, R.K., L.A. Raubeson, J.L. Boore, C.W. de Pamphilis, T.W.  
Chumley, R.C. Haberle, S. K. Wyman,A. J.Alverson, R. Peery,  
S. J. Herman, H. M. Fourcade, J. V. Kuehl, J. R. McNeal, J.  
Leebens-Mack, and L. Cui. 2005. Methods for obtaining and  
analyzing whole chloroplast genome sequences.  
Meth.Enzymol. 395: 348-384.  
KESSLER, C., H. Höltke, R. Seibl, J. Buró, and K.Mühlegger. 1990.  
Non-radioactive labeling and detection of nucleic acids.A novel  
DNAlabeling and detection system based on digoxigenin: Anti-  
digoxigenin ELISA Principle (digoxigenin system). Biol. Chem.  
Hoppe-Seyler. 371:917-927.  
KOLODNER, R., and K.K. Tewari. 1979. Inverted repeats in  
chloroplast DNA from higher plants. Proc Natl. Acad. Sci. 76:  
4
1-45.  
KOYA, V., and H. Daniell. 2005. OBPC symposium: maize 2004 &  
beyond – Recent advances in chloroplast genetic engineering.  
In vitro Cell. Develop. Biol. – Plant. 41:388-404.  
LEISTER, D. 2003.Chloroplast research in the genomic age. Trends  
Genet. 19: 47-56  
PALMER, J.D. 1987. Chloroplast DNA evolution and biosystematic  
uses of chloroplast DNA variation. Am. Nat. 130:S6-S29.  
RUIZ, G. 2002. Optimization of codon composition and regulatory  
elements for expression of the human IGF-1 in transgenic  
chloroplasts. M.S. thesis, University of central Florida,  
Orlando.  
Literatura citada  
AGUADO-SANTACRUZ, G.A., D.A. Betancourt-Guerra, T. Siquerios-  
Cendón, S.Arévalo-Gallegos, B. Rivera-Chavira, G.V. Nevárez-  
Moorillon, B.M. Moreno-Gómez and Q. Rascón-Cruz. 2011.  
Comparison of the structure and organization of the rrna  
operons of Bouteloua gracilis and Zea mays. Can. J. Plant  
Sci. 91:107-116.  
BLAUSTEIN, D.R., Johnson, and D. Mathieu. 1998. Biology. The  
dynamics of life. McGraw-Hill. Cap. 8:204.  
BOGORAD, L. 2000. Engineering chloroplasts; an alternative site  
for foreign genes, proteins, reactions and products. Trends  
Biotechnol.18:257-263.  
BOOKJANS, G., B.M. Stummann, and K. Henningsen. 1984.  
Preparation of chloroplast DNA from pea plastids isolated in a  
medium of high ionic-strength. Anal. Biochem. 141: 244-247.  
CHEBOLU, S. and H. Daniell. 2007. Stable expression of GAL/  
GALNAclectin of Entamoeba histolytica in transgenic  
chloroplast and immunogenicity in mice towards vaccine  
development for amebiasis. Plant Biotech. J. 2:230-239.  
DANIELL, H., M.S. Khan, and L. Allison. 2002. Milestones in  
chloroplast genetic engineering: an environmentally friendly  
era in biotechnology. Trends Plant Sci. 7:84-91  
SAGER, R., and M. R. Ishida. 1963. Chloroplast DNA in  
Chlamydomonas. Biochemistry 50: 725-730.  
SCOTT, S.E., and M. J. Wilkinson. 1999. Low probability of  
chloroplast movement from oilseed rape (Brassica napus)  
into wild Brassica rapa. Nat. Biotechnol. 17:390-392.  
SOUTHERN, E. 1975.Detection of specific sequences among DNA  
fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol.  
98:503-517.  
SUGIURA, M. 1992. The chloroplast genome. Plant Mol. Biol. 19:  
149- 168.  
TREGONING, J.S., P. Nixon, H. Kuroda, Z. Svab, S. Clare, F. Bowe,  
N. Fairweather, J. Ytterberg, K. Van Wijk, G. Dougan, and P.  
Maliga. 2003. Expression of tetanus toxin fragment C in  
Tobacco chloroplasts. Nucleic Acid Res. 31:1174-1179.  
TRIBOUSH, S.O., N.G. Danielenko, and O.G. Davydenko. 1998. A  
method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA  
from sunflower. Plant Mol. Biol. 16: 183-189.  
VIRUPAKSHI, S., and G. Naik. 2007. Purification of DNA from  
chloroplast and mitochondria of sugarcane. Curr. Sci. 92:  
1613-1619.  
DIEKMANN, K., T. Hodkinson, E. Fricke, and S. Barth. 2008. An  
optimized chloroplast DNA extraction protocol for grasses  
(
Poaceae) proves suitable for whole plastid genome  
sequencing and SNP detection. PLoS ONE 3: 7.  
Este artículo es citado así:  
Hernández-Quezada, D. I., S.Arévalo-Gallegos, D. A. Betancourt-Guerra,A.Aguado-Santacruz, T.  
Siqueiros-Cendón, B. Rivera-Chavira, G. V. Nevárez-Moorillon y Q. Rascón-Cruz. 2011: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares.  
TECNOCIENCIA Chihuahua 5(3): 132-139.  
1
38  
• Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •  
DAVID I. HERNÁNDEZ-QUEZADA, SIGIFREDO ARÉVALO-GALLEGOS, DAVID A. BETANCOURT-GUERRA, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ, TANIA  
SIQUEIROS-CENDÓN, BLANCA RIVERA-CHAVIRA, GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ-MOORILLON Y QUINTÍN RASCÓN-CRUZ: Método para la  
extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares  
Resúmenes curriculares de autor y coautores  
DAVID IGNACIO HERNÁNDEZ QUEZADA. Terminó su licenciatura en el 2010, año en que le fue otorgado el título de Químico Bacteriólogo Parasitólogo  
por la Facultad de Ciencias Químicas de la UniversidadAutónoma de Chihuahua. Recibió el premio al modelo atómico en la FCQ 2006. Llevó  
a cabo la presentación de su trabajo de tesis en la semana de química del 2010. Asistente de investigación en la empresa INOVAK 2008.  
SIGIFREDO ARÉVALO GALLEGOS. Estudio para Químico Bacteriólogo Parasitólogo Facultad de Ciencias Químicas de la UACH, realizó una  
Maestría en Ciencias (Biología Molecular), CINVESTAV-IPN, el Doctorado en Ciencias (Biología Molecular), CINVESTAV-IPN. Posdoctorado  
(Biología Molecular); Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, New York, N.Y. U.S.A.Actualmente labora en la Facultad de  
Ciencias Químicas de la UACH y posee la categoría de Académico titular C. Tiene 11 artículos publicados en revistas indexadas 25  
memorias en extenso en revistas arbitradas, 14 artículos de divulgación, 4 capítulos en libro. Trabajos de investigación dirigidos: 8 Tesis  
de licenciatura, 13 de Maestría en Ciencias y uno de Doctorado en Ciencias. Proyectos de investigación con financiamiento externo: 7.  
Reconocimientos a trabajos de investigación dirigidos: 3 Internacionales; 3 Nacionales; 4 Estatales y 5 Locales.  
DAVID ADRIÁN BETANCOURT GUERRA. Terminó su licenciatura en el 2004, año en que le fue otorgado el título de Químico Bacteriólogo Parasitólogo  
por la Facultad de Ciencias Químicas de la UniversidadAutónoma de Chihuahua. Realizó estudios de Maestría en Ciencias en Biotecnología  
finalizando en el 2007. Llevó a cabo un diagnóstico molecular de tuberculosis en 2008 en el Laboratorio Médico Especializado. En el medio  
académico desde el 2010 he impartido cátedra de Biología Forense, Biología Molecular y Genética Forense en el posgrado del Instituto de  
Ciencias Biomédicas de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ). Es Perito en Genética forense en el Laboratorio de Genética  
Forense e Identificación Humana de la Dirección de Servicios Periciales en la Zona Norte desde 2006 a la fecha.  
GERARDO ARMANDO AGUADO SANTACRUZ. Cursó la carrera de Biólogo con mención honorífica por parte de la Universidad Autónoma de  
Aguascalientes, es Maestro en Botánica por el Colegio de Postgraduados y Doctor en Biotecnología por el CINVESTAV-Unidad Irapuato.  
Es investigador del INIFAP desde el año de 1986, donde actualmente se desempeña como Investigador Titular y Jefe del Laboratorio de  
Biotecnología Microbiana y Fisiología Molecular de Plantas en el Campo Experimental Bajío, en Celaya, Guanajuato. Miembro del SNI desde  
1998, actualmente con nombramiento de Investigador Nacional Nivel II. Es autor de 55 publicaciones entre las que se incluyen 19 artículos  
en revistas de circulación internacional y 9 en revistas nacionales con arbitraje, 5 capítulos de libros. En el año de 2008, el Dr. Aguado  
Santacruz recibió el Premio de Innovación Tecnológica por parte del Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Guanajuato por el  
desarrollo de biofertilizantes bacterianos que ayudan a reducir las dosis de fertilización química en maíz de temporal.  
TANIA SIQUEIROS CENDÓN. Terminó su licenciatura en 2002, recibiendo el título de Química Bacterióloga Parasitóloga con Mención Honorífica  
por la Facultad de Ciencias Químicas de la UACh. Obtuvo el grado de Maestra en Ciencias en Biotecnología también con mención  
Honorífica en el 2006. Desde el 2002 labora en la Facultad de Ciencias Químicas de la UACh como responsable del departamento de  
secuenciación y en 2010 se incorporó a la Facultad como Profesor de Tiempo Completo. En 2009 recibió por parte de Gobierno del Estado  
de Chihuahua el premio Chihuahua en la categoría de Ciencias Biológicas. Su área de especialidad es la Biología Molecular, Inmunología  
y Microbiología. Ha sido asesora de 6 tesis de Licenciatura y 10 Tesis de Maestría. Ha presentado varios trabajos de investigación a nivel  
Nacional e Internacional.Es autora de 4 artículos científicos, más de 15 ponencias en congresos, y 1 capítulo de libro científico.  
BLANCA RIVERA CHAVIRA. Realizó estudios como Químico Bacteriólogo Parasitólogo 1983 y Realizó estudios de Doctorado en Biología  
Molecular en le CINVESTAV- Zacatenco, finalizando en 1989. Actualmente es profesor titular C en la Facultad de ciencias Químicas de la  
UACh desde 1991. Ha publicado 6 artículos en revistas inidzadas, dos de divulgación y tiene capítulos de libro. Ha presentado más de 20  
trabajos en congresos nacionales e internacionales. Ha graduado estudiantes de 6 de licenciatura y 6 de Maestría en Ciencias en  
Biotecnología. Es profesor titular en la Facultad de Ciencias Químicas de la UACh desde 1988 a la fecha.  
GUADALUPE VIRGINIA NEVÁREZ MOORILLÓN. Cursó su licenciatura en la Facultad de Ciencias Químicas de la UniversidadAutónoma de Chihuahua  
(UACH), recibiendo el título de Químico Biólogo Parasitólogo. Realizó estudios de doctorado en la University of North Texas con la tesis  
«Biodegradación de componentes de petróleo contaminantes en aguas y suelos por bacterias del suelo»; en 1995 se le otorgó el grado  
de Ph.D., especialidad Biología. Ha recibido más de siete distinciones y premios, incluyendo el Premio Nacional en Ciencia y Tecnología de  
Alimentos en la Categoría Profesional (2006). Pertenece al Sistema Nacional de Investigadores Nivel I. Desde 1995 ha sido maestra de la  
Facultad de Ciencias Químicas (UACH) y su productividad científica incluye más de treinta artículos en revistas arbitradas; ha editado más  
de cuatro libros y dirigido más de 60 tesis (licenciatura, maestría y doctorado). La Dra. Nevárez pertenece a diversas sociedades  
científicas, citándose entre algunas de ellas la American Society for Microbiology, la Society for Microbial Ecology y la Sociedad Mexicana  
de Biotecnología y Bioingeniería.  
QUINTÍN RASCÓN CRUZ. Terminó su licenciatura en 1992, como Químico Bacteriólogo Parasitólogo por la Facultad de Ciencias Químicas de la  
Universidad Autónoma de Chihuahua (UACH). Realizó estudios de posgrado como Maestro en Ciencias en Inmunología en UACh/FCQ y  
obtuvo el doctorado en Biotecnología de Plantas por el CINVESTAV Irapuato en 2003. Actualmente labora en la Facultad de Ciencias  
Químicas de la UACH y posee la categoría deAcadémico Titular C. Ha sido miembro del Sistema Nacional de Investigadores Nivel I desde  
2003. Su área de especialización es Biotecnología en plantas. Ha dirigido 11 tesis de licenciatura, 16 de maestría y 2 de doctorado. Es autor  
de aproximadamente 25 artículos científicos, más de 45 ponencias en congresos, y 2 capítulos de libros científicos; además ha recibido  
distinciones nacionales y estatales por sus trabajos de investigación (Premio Chihuahua 1997 y 2003), Premio Alfredo Sánchez  
Marroquín 2004) ha dirigido 5 proyectos de investigación financiados por fuentes externas. Es evaluador de proyectos de investigación  
del CONACYT (Fondos institucionales, mixtos y sectoriales) y Fundación Produce Chihuahua, es revisora del seguimiento de los Fondos  
sectoriales Sagarpa-Conacyt, y es coordinador del Consejo Consultivo Científico de la Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de los  
Organismos Genéticamente Modificados 2009-2011.  
1
39  
•
Vol. V, No. 3 • Septiembre-Diciembre 2011 •