Medio Ambiente y Desarrollo Sustentable  
Artículo arbitrado  
Técnicas serológicas y moleculares utilizadas  
para la identificación y caracterización de  
Beet curly top virus  
Serological and molecular techniques used for the identification  
and characterization of Beet curly top virus  
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LORETO ROBLES-HERNÁNDEZ , LUIS CARLOS CHAVIRA-SÁENZ , MARÍA TERESA SÁENZ-GUTIÉRREZ  
1,2  
Y ANA CECILIA GONZÁLEZ-FRANCO  
Recibido: Diciembre 20, 2012  
Aceptado: Agosto 9, 2013  
Resumen  
Abstract  
El Beet curly top virus pertenece al género curtovirus, dentro de  
la familia Geminiviridae; su genoma está constituido por una  
cadena sencilla de ADN cubierto por una cápside icosaédrica  
geminada. La organización de su genoma revela que el ADN de  
los curtovirus produce seis o siete proteínas. El producto del  
ORF V1 es la proteína de la cápside del virión, el del ORF V2 está  
involucrado en la regulación de los niveles de ADN genómico y el  
del ORF V3 facilita el movimiento de célula a célula. Las cuatro  
proteínas codificadas por los ORFs de sentido complementario  
están involucradas en la replicación del virus. ORF C1 codifica  
la proteína Rep, C3 una proteína análoga para la replicación de la  
proteína de los begomovirus, y la C4 es una proteína que puede  
iniciar la división celular; la función de la C2 es desconocida. Las  
especies de BCTV causan enfermedades en cultivos hortícolas  
como chile, frijol y tomate, los cuales son económica y socialmente  
importantes en el estado de Chihuahua; sin embargo, hay muy  
poca información de este virus en el estado, es por eso que en  
esta revisión enfatizamos en las técnicas serológicas y  
moleculares para la identificación del virus, así como en los  
métodos de clonación, secuenciación y análisis filogenético para  
su caracterización, con el fin de poner a disposición esta  
información para técnicos e investigadores interesados en  
estudios específicos del BCTV, así como en el manejo de las  
enfermedades causadas por las cepas de este virus.  
Beet curly top virus belongs to the genus Curtovirus, within the  
family Geminiviridae; its genome is composed of a single  
stranded DNA covered with an icosahedral geminate capsid.  
The organization of its genome reveals that Curtovirus DNA  
produces six or seven proteins. The product of ORF V1 is the  
virion coat protein, that of ORF V2 is involved in regulation of  
the genomic DNA levels, and that of ORF V3 facilitates the cell-  
to-cell movement of the virus. The four proteins encoded by the  
complementary-sense ORFs are involved in virus replication.  
ORF C1 encodes the Rep protein, C3 a protein analogous to the  
replication enhancer protein of begomoviruses, and C4 a protein  
that can initiate cell division; the function of C2 is unknown. The  
species of BCTV cause diseases in horticultural crops such as  
beans, pepper, and tomato that are economically and socially  
important in Chihuahua State. However, there is limited  
information about this virus in the State. Thus, in this review,  
we emphasize the serological and molecular methods for  
identification of this virus, as well as the clonation, sequencing,  
and phylogenetic analysis for its characterization with the  
objective of providing this information to technicians and  
researchers interested in specific studies of BCTV, as well as  
in the management of the diseases caused by strains of this  
virus.  
Keywords: Curtovirus, Geminivirus, typing of BCTV,  
Palabras clave: Curtovirus, Geminivirus, tipificación de BCTV,  
sequencing methods, clonation, phylogenetic analysis.  
métodos de secuenciación, clonación, análisis filogenético.  
_
________________________________  
1
UniversidadAutónoma de Chihuahua, Facultad de CienciasAgrotecnológicas, Ciudad Universitaria S/N Campus 1, Chihuahua, Chih.,  
México. 31310.  
Dirección electrónica del autor de correspondencia: conzalez@uach.mx.  
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LORETO ROBLES-HERNÁNDEZ, LUIS CARLOS CHAVIRA-SÁENZ, MARÍA TERESA SÁENZ-GUTIÉRREZ Y ANA CECILIA GONZÁLEZ-FRANCO:  
Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
Introducción  
l Beet curly top virus (BCTV) causa enfermedades en cerca de 300 especies de  
plantas, entre las que se incluyen hortalizas, plantas ornamentales y malezas; las  
E
hortalizas más susceptibles son chile verde, tomate, espinacas, betabel y frijol (Bajili  
et al., 2006; Chen et al., 2011).  
Existen pocos trabajos sobre el BCTV en  
México. Velásquez y Medina (2008) reportaron  
la especie Beet mild curly top virus (BMCTV)  
en el cultivo de chile en los estados de  
Zacatecas y Aguascalientes. En Chihuahua se  
reportó la especie Beet severe curly top virus  
en cultivos de chile, con una incidencia de 11.7%  
registrado para la región centro sur del estado  
especies Beet curly top virus (BCTV), Beet mild  
curly top virus (BMCTV), Beet severe curly top  
virus (BSCTV), Spinach curly top virus (SCTV),  
Horseradish curly top virus (HrCTV), Beet curly  
top iran virus (BCTIV) y Pepper yellow dwarf virus  
(PepYDV), los cuales no han sido plenamente  
caracterizados (Fauquet et al., 2008; Chen et  
al., 2011).  
(
Robles-Hernandez et al., 2011). Sin embargo,  
El BCTV se caracteriza por tener un  
genoma monopartita deADN en cadena sencilla,  
con un tamaño aproximado de 3.0 kb, cubierto  
por una cápside formada por dos icosaedros  
geminados casi isométricos (Figura 1); la  
cápside está constituida por un mismo tipo de  
proteína de 30 kilodaltons (Creamer et al., 2005;  
Chen et al., 2010; Durrin et al., 2010).  
se desconoce si estas cepas son nativas o  
introducidas de otros países. Es por eso que  
en este trabajo se presentan detalladamente las  
técnicas serológicas y moleculares que se  
emplean para la identificación de especies de  
BCTV, así como los métodos más recientes de  
secuenciación y análisis filogenético de estas  
cepas de virus, con el fin de contar con una  
panorámica general de las herramientas con  
potencial para iniciar trabajos de investigación  
que permitan construir una caracterización  
completa de las cepas de virus reportadas en  
el estado de Chihuahua, y llevar a cabo un mejor  
manejo de las enfermedades que causan estos  
virus en los cultivos de chile, frijol y tomate.  
Figura 1. Esquematización de la cápside icosaédrica y geminada  
del BCTV. El color verde representa una sola clase de proteína  
(Fuente: http://viralzone.expasy.org/all_by_species/109.html).  
Taxonomía  
Todas las especies de virus pertenecientes  
a la familia Geminiviridae tienen como  
característica un genoma de ADN de una sola  
cadena, empaquetado en una cápside  
icosaédrica geminada. Los geminivirus se  
clasifican en cuatro géneros: Mastrevirus,  
Curtovirus, Topocovirus y Begomovirus; la  
diferencia y división entre estos géneros está  
sustentada en la organización de su genoma,  
las propiedades biológicas, el rango de  
hospederos y en el tipo de insecto vector que  
los disemina (Fauquet et al., 2008). Dentro del  
género Curtovirus se tienen identificadas las  
Descripción del genoma  
En el 2002, Hull reportó una clona infecciosa  
de BCTV con 2993 nucleótidos de longitud. La  
organización de su genoma revela que el ADN  
de los curtovirus produce seis o siete proteínas  
(Figura 2), las cuales están involucradas en  
todas las actividades de replicación, movimiento  
y supervivencia del virus. El producto del ORF  
V1 es la proteína de la cápside del virión, el del  
ORF V2 está involucrado en la regulación de  
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Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
los niveles deADN genómico de cadena sencilla  
ss) o de cadena doble (ds), y el del ORF V3  
Formas de replicación  
(
La replicación de los geminivirus depende  
de las funciones de la célula del hospedero. Los  
geminivirus se replican en células diferenciadas  
que están en su fase G, es decir, cuando éstas  
han terminado la mayoría de sus actividades  
de replicación de ADN. Los geminivirus  
reactivan las actividades de replicación que ellos  
requieren y regresan a la célula a su fase S  
facilita el movimiento de célula a célula del virus.  
Las cuatro proteínas codificadas por los ORFs  
de sentido complementario están involucradas  
en la replicación del virus. El ORF C1 codifica  
la proteína Rep, C3, una proteína análoga para  
la replicación de la proteína de los begomovirus,  
y la C4 es una proteína que puede iniciar la  
división celular; la función de la C2 es  
desconocida (Hull, 2002).  
(
(
Hull, 2002). Se cree que la síntesis de la hebra  
-) del ADN viral se inicia a partir de un  
En estudios más recientes, se reporta que  
la V1 está implicada en la codificación de las  
proteínas de la cápside, la proteína V2, participa  
en la regulación delADN (Baliji et al., 2007). Por  
otro lado, se menciona la participación  
específica de la proteína C4 en el movimiento  
del virus, ya que se ha mostrado que en  
mutaciones de aislados de virus con cambios  
a nivel de nucleóticos en C4 e inoculados en  
plantas indicadoras no desplazaban hacia las  
hojas nuevas de la planta; este hallazgo  
evidenció la relación de la proteína C4 con el  
movimiento del virus y posiblemente con su  
patogenicidad (Teng et al., 2010).  
oligonucleótido complementario de la región  
intergenómica 3’. Este oligonucleótido puede ser  
extendido por laADN-polimerasa in vitro y podría  
ser el iniciador in vivo de la cadena (-) en los  
masterovirus; sin embargo, poco se conoce en  
relación a las proteínas y los mecanismos  
involucrados en la síntesis de la cadena (-) en  
los geminivirus, y se piensa que la síntesis de  
esta cadena es afectada por los factores del  
hospedero. Por otro lado, la síntesis de la hebra  
(+) de los geminivirus se da en un sitio específico  
del anillo de la horquilla (TAATAATTAC) del  
ADN in vivo. La síntesis de la hebra (+) está  
regulada por la proteína Rep, la cual actúa como  
endonucleasa y ligasa para cortar y pegar la  
hebra (+) delADN viral en la misma posición en  
la cadena in vitro. Se piensa que el origen de la  
cadena (+) se encuentra en el lado izquierdo  
de ésta, la cual tiene una región constante (como  
en el caso del TGMV) y se traslapa con el  
promotor AC61. Se han identificado seis  
elementos cis en esta región: 1) el elemento  
horquilla es común en los genomas de los  
geminivirus. Este elemento tiene una región  
rica en GC en el tallo y otra región rica en AT  
en el anillo. La secuencia conservada 5’  
TAATAATTAC del anillo es común en todos  
los geminivirus y se encuentra en el origen de  
la hebra (+) de otros ácidos nucleicos que se  
replican a través del círculo rodante (Zúñiga-  
Vega, 2002). 2) El sitio de unión de la proteína  
Rep presenta varias características: (i) es  
específico para el virus pero tiene algunas  
secuencias constantes, (ii) el GGAT es un  
requerimiento absoluto, (iii) el espacio entre  
Figura 2. Organización del genoma de BCTV. El círculo  
representa el ADNss, la línea continua la región común. Las  
flechas dentro del círculo son los ORFs y sus productos, los  
cuales están involucrados en todas las actividades de  
replicación, movimiento y permanencia viral (Fuente: http://  
www.springerimages.com/Images/RSS/1-10.1007_3-540-  
2
9719-7_56-1).  
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Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
GGAT es importante. 3) El origen de la hebra  
+) de los curtovirus comparte sitios de unión  
pertenece al orden hemíptera y es de la familia  
Cicadellidae; es un insecto en forma de cuña  
que mide aproximadamente 3 mm, el cual se  
torna de color verde pálido a gris; su aparato  
bucal es de tipo chupador, es de movimientos  
rápidos y es difícil detectar en forma individual,  
solamente puede ser visto en conjunto en las  
hojas de las plantas (Nischwitz y Olsen, 2011).  
(
para dos factores de transcripción, la caja TATA  
y la caja G. Ni los factores de transcripción del  
hospedero ni los sitios de unión son requeridos  
para la replicación del virus. 4) Los otros dos  
elementos son la región AG y la región CA. La  
primera región es esencial para la replicación  
del virus, pero no se ha detectado ningún papel  
en la transcripción del AG61. Remoción de la  
región CA redujo la replicación de TGMV hasta  
Figura 4. Insecto Circulifer tenellus (salta-hojas) transmisor  
específico del BCTV (Fuente: http://cals.arizona.edu/yavapai/  
graphics/beetleafhoper.jpg).  
20 veces y dicha mutación sugiere que actúa  
como un elemento eficiente. Aunque el  
mecanismo por el cual estos elementos operan  
no se ha determinado, se sugiere que podrían  
unirse a los factores de la planta que son  
requeridos para la replicación del virus. La  
proteína Rep es esencial para la replicación de  
los geminivirus. Esta proteína es multifuncional  
y tiene varias características: se encuentra en  
el núcleo, tiene sitios de reconocimiento  
específicos, tiene actividad de endonucleasa,  
ligasa, ATPasa y de GTPasa. La proteína Rep  
también funciona como promotor del gen de  
ARNm para la síntesis de la proteína de la  
cápside (Hull, 2002) (Figura 3).  
Debido al amplio rango de plantas  
hospederas, el BCTV puede alojarse en  
malezas y posteriormente ser transportado por  
su vector a los cultivos hortícolas hospederos.  
El vector es un insecto de migración anual, en  
temporada invernal los adultos se alojan en  
malezas perenes iniciando así su ciclo  
reproductivo. El virus se puede alojar en el  
insecto desde la etapa ninfal y permanecer en  
él hasta el término de su ciclo de vida. En  
primavera, los insectos emigran hacia zonas  
agrícolas transmitiendo el virus en el momento  
en que el insecto introduce el estilete para  
succionar la savia de la planta, diseminándolo  
de planta en planta (Chen et al., 2010).  
Figura 3. Diagrama representativo de la replicación de un  
geminivirus (Hull, 2002).  
Sintomatología de plantas  
infectadas por BCTV  
Las enfermedades provocadas por BCTV  
han causado importantes pérdidas de cultivos  
en distintas regiones de Estados Unidos y en  
México. De acuerdo con las investigaciones  
realizadas, el BCTV infecta a una amplia gama  
Formas de transmisión  
El BCTV se transmite solamente a través  
del insecto Circulifer tenellus, comúnmente  
conocido como chicharrita (Figura 4), que  
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Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
de cultivos, entre los que destacan, frijol, chile  
verde, espinacas y tomate (Creamer et al.,  
Durante el desarrollo de la enfermedad se  
presentan algunos síntomas que pueden ser  
similares en todos los cultivos afectados por  
virus. Sin embargo, también se presentan  
síntomas que son específicos para cada cultivo  
(Figura 5). En el caso del chile, las plantas  
jóvenes presentan enanismo, clorosis y rizado  
de hojas; en plantas en etapas de desarrollo  
avanzado se presenta una disminución en el  
amarre de fruto, también se pueden presentar  
hojas duras y quebradizas (Creamer, 2005).  
2005; Chen et al., 2010; Chen et al., 2011). El  
nombre de la enfermedad no está bien definido,  
por lo tanto, su diagnóstico se basa en los  
síntomas característicos que se presentan en la  
mayoría de los cultivos. El proceso de infección  
en los cultivos se da cuando el insecto vector se  
alimenta de las plantas, inoculando con el aparato  
bucal el virus que pudo haber adquirido durante  
su etapa de desarrollo (Chen et al., 2010).  
Figura 5. Síntomas característicos causados por BCTV en diferentes cultivos hortícolas. A) hojas rizadas y quebradizas de chile, B)  
hojas cloróticas de chile,, C) hojas cloróticas de frijol, D) hojas epinásticas de frijol, E) hojas de tomate con decoloración púrpura  
y rizadas hacia arriba y F) hojas de tomate pequeñas, rizadas y quebradizas (Fuente: A y B – proporcionadas por Loreto Robles  
Hernández; C y D – Schwartz et al., 2005; E y F – http://www.coopext.colostate.edu/TRA/PLANTS/curlytopvirus.shtml).  
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Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
En el cultivo de frijol, durante los primeros  
estadios de crecimiento se presenta epinastia,  
Las técnicas serológicas que más se  
rizado en las primeras hojas trifoliadas, distorsión  
Técnicas serológicas  
emplean para el diagnóstico de enfermedades  
en las puntas de crecimiento y muerte en las  
causadas por virus en plantas es la prueba de  
ELISA(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay),  
que se basa en la unión covalente de enzimas  
con anticuerpos, de manera que se conservan  
las propiedades catalíticas de las enzimas y la  
especificidad de los anticuerpos; existen  
variaciones sobre esta técnica, los cuales se  
describen a continuación. El método de ELISA  
indirecto se basa en la adsorción del antígeno a  
una placa de poliestireno, seguida de la adición  
del anticuerpo específico, el cual reacciona con  
el antígeno adherido a la placa. Posteriormente,  
se siguen los mismos pasos del método  
anterior, adición de la enzima ligada al  
anticuerpo, incorporación del sustrato y lectura  
de absorbancias en el lector de microplacas,  
recordando que cada uno de los pasos de cada  
reacción lleva un tiempo de incubación (Madigan  
et al., 2003; Roitt et al 2003). El método directo  
de doble anticuerpo tipo sándwich (DAS-ELISA)  
consiste principalmente en la adsorción de  
anticuerpos específicos a una placa de  
poliestireno a la cual se le adiciona el antígeno  
presente en la muestra. Una vez que se lleva a  
cabo la unión antígeno-anticuerpo, se adiciona  
un segundo anticuerpo, el cual está ligado a una  
enzima que va a reaccionar con el complejo  
antígeno anticuerpo formado previamente. Una  
vez formado este complejo, se adiciona un  
sustrato como indicador de la reacción, que  
suministra una coloración directamente  
proporcional a la concentración de antígeno  
presente en la muestra (Robles et al., 2010b).  
Una variante de esta prueba es el triple  
anticuerpo tipo sándwich (TAS-ELISA). El  
fundamento de esta técnica surge a partir de la  
obtención de antisueros (suero con anticuerpos  
producidos por animales de laboratorio), el cual  
se obtiene mediante inmunizaciones en conejos  
o cobayos, principalmente. Estos anticuerpos  
son adsorbidos en una placa de poliestireno,  
luego se adiciona el extracto vegetal para  
provocar la unión del antígeno con el anticuerpo  
yemas secundarias; las primeras hojas se tornan  
amarillas y la planta puede morir en pocas  
semanas, también se produce enanismo en la  
planta y las hojas se vuelven gruesas y  
quebradizas; en infecciones tardías, las plantas  
pueden madurar y producir pocas vainas si éstas  
se forman antes de la infección; las hojas  
trifoliadas que se formaron parcialmente durante  
la infección primaria pueden permanecer de un  
color verde oscuro y con malformaciones rizadas  
hacia abajo (Zitter, 2001; Nischwitz y Olsen, 2011).  
En el cultivo de tomate, las hojas de plantas  
infectadas se vuelven pequeñas, se tornan  
quebradizas y se rizan hacia arriba; las venas en  
el envés de la hoja presentan una decoloración  
púrpura y frecuentemente se hinchan; las raíces  
detienen su crecimiento y exhiben una proliferación  
de raíces secundarias; el tejido de floema  
presenta necrosis y aparece como círculos  
oscuros en un corte transversal (Zitter, 2001).  
Técnicas de identificación y  
cuantificación de BCTV  
Debido a la naturaleza de los virus, resulta  
complicado, y a veces implica grandes costos,  
poder cultivarlos y aislarlos in vitro, ya que  
requieren de condiciones y sustratos altamente  
específicos y de un microscopio electrónico para  
poderlos visualizar; como alternativa, se han  
desarrollado técnicas específicas que arrojan  
resultados convincentes de su presencia (Madigan  
et al., 2003). Dentro de las técnicas más comunes  
y factibles para la identificación de Beet curly top  
virus se encuentran la identificación de síntomas,  
pruebas fisiológicas en plantas indicadoras,  
prueba de serología y técnicas moleculares  
(
Robles-Hernández et al., 2010a). Dichas  
técnicas se utilizan ampliamente para la  
identificación y caracterización de diferentes tipos  
de virus fitopatógenos en el estado de Chihuahua  
(
Robles-Hernández et al., 2010b y Robles-  
Hernández et al., 2011). A continuación se  
describen algunas de las más comunes.  
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Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
primario; posteriormente se agregan otra serie  
de anticuerpos procedentes de otro proceso de  
inmunización, los cuales se unen al complejo  
antígeno-anticuerpo formado previamente. Para  
completar el proceso se adicionan anticuerpos  
conjugados con una enzima en donde se unen  
al complejo anticuerpo antígeno-anticuerpo;  
seguidamente, después de un período de  
incubación se adiciona un sustrato, el cual  
reaccionará con la enzima y suministrará una  
coloración directamente proporcional a la  
concentración de antígeno, la cual también  
se refleja con la medición de absorbancia  
fragmentos cortos de ADN de cadena sencilla  
complementarios a los extremos del fragmento  
a amplificar. Estos fragmentos se conocen  
como cebadores o primers. Todo este proceso  
se desarrolla en varios ciclos programados en  
un sistema, que permiten la desnaturalización,  
hibridación y elongación delADN hasta obtener  
el número de copias deseado (Campbell y  
Farrell, 2004). Finalmente, para corroborar la  
amplificación del ADN se hace una separación  
de fragmentos de cadena de ADN mediante la  
técnica de electroforesis utilizando matrices de  
agarosa o poliacrilamida. Esta técnica de  
electroforesis se basa en el movimiento de  
partículas cargadas en un campo eléctrico,  
hacia un electrodo con carga opuesta; como  
fase inmóvil se suele emplear papel, y en el  
más común de los casos se utiliza gel de  
agarosa; como fase móvil se utiliza una  
solución amortiguadora que facilite el  
movimiento de los fragmentos de ADN  
(Vidhyasekaran, 2003; Durrin et al., 2010).  
De todas las variantes del método ELISA,  
la más utilizada para la identificación de las  
especies del BCTV es la técnica TAS-ELISA,  
debido a que es un método que tiene menos  
interferencia y es más sensible en la detección  
de este virus; esta técnica fue aplicada por  
Durrin et al. (2010) para la inmunodetección de  
dos cepas de Curtovirus en remolacha  
azucarera. Robles et al. (2011) aplicaron con  
éxito esta técnica para la identificaron de Beet  
severe curly top virus en el cultivo de chile en el  
estado de Chihuahua.  
(
Campbell y Farrell, 2004; Chen et al., 2010;  
Chen et al., 2011; Robles-Hernández et al.,  
011).  
Reacción en cadena de la polimerasa en  
2
tiempo real. Esta técnica se basa en la  
detección y medición de productos generados  
durante la PCR, de esta forma, es necesario  
disponer de un método que exprese la  
acumulación del producto de PCR y un aparato  
que registre los resultados durante los ciclos  
de la reacción; el proceso de amplificación y  
detección se produce de manera simultánea en  
el mismo vial cerrado, sin necesidad de alguna  
acción posterior. Esta técnica emplea un  
sistema de detección por fluorescencia, por  
medio de esto, se puede medir la cantidad del  
ADN producido en cada uno de los ciclos de  
amplificación, dado que la emisión de  
fluorescencia es directamente proporcional a la  
cantidad de ADN amplificado, permitiendo así  
su cuantificación; el número de ciclos que se  
necesitan para que la señal de fluorescencia  
alcance el nivel umbral se conoce como  
Técnicas moleculares  
Las técnicas moleculares son otra  
alternativa para el estudio y diagnóstico de  
enfermedades virales en plantas. Dichas  
técnicas se caracterizan por ser altamente  
sensibles y se basan en la manipulación de  
ácidos nucleicos aprovechando las propiedades  
singulares, en particular las del ADN (Zúñiga-  
Vega, 2002); los métodos para determinar la  
secuencia de bases del ADN emplean la  
manera en que éste se replica (Campbell y  
Farrell, 2004; Agrios, 2005; Chen et al., 2011).  
Reacción en cadena de la polimerasa  
(PCR). La PCR (Polymerase Chain Reaction,  
por sus siglas en inglés) es una técnica muy  
utilizada en biotecnología, consiste en generar  
una gran cantidad de copias de un fragmento  
de ADN y parte del requisito fundamental para  
que se lleve a cabo la reacción, es disponer de  
Threshold cycle (C , por su siglas en inglés).  
T
Algunos hallazgos contribuyeron al desarrollo  
de la PCR en tiempo real; uno de ellos es que  
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Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
la Taq polimerasa posee actividad de  
exonucleasa, y el otro es la construcción de  
sondas de oligonucleótidos con doble marcaje,  
basadas en el principio de transferencia de  
energía fluorescente mediante resonancia o  
FRET (Costa, 2004). La técnica de PCR en  
tiempo real ha sido utilizada para la identificación  
de Curtovirus en cucurbitáceas como melón y  
calabacita (Chen et al., 2009).  
cual se introduce el ADN generado durante el  
proceso de amplificación (Madigan et al., 2003).  
En el caso de los Geminivirus, algunas de las  
plantas que se usan como hospederos son  
Nicotiana tabacum, Arabidopsis spp. y Nicotiana  
benthamiana, inclusive se pueden utilizar  
plantas de los cultivos a los que ataca.  
Chen et al. (2010) iniciaron el proceso de  
clonación de Beet mild curly top virus a partir  
de plantas de chile con los síntomas  
característicos causados por este virus. El  
material genético del virus se extrajo, se hizo la  
clonación y posteriormente el producto se  
introdujo en plantas de Nicotiana tabacum,  
observándose que el análisis de secuenciación  
fue muy similar a los resultados de  
secuenciación obtenidos del material genético  
clonado proveniente de plantas de chile (Chen  
et al., 2010). Este tipo de técnicas resultan ser  
muy útiles, ya que se puede obtener de forma  
rápida una gran cantidad de material genético,  
el cual se puede utilizar para una identificación  
más segura de Geminivirus. Un trabajo similar  
fue realizado por Baliji et al. (2007) con el  
Spinach curly top virus, sólo que en este caso  
utilizaron Arabidopsis spp. como huésped para  
introducir el material clonado (Baliji et al., 2007).  
Método de clonación de BCTV  
Para poder multiplicarse, los virus requieren  
parcial o totalmente de la maquinaria de la  
célula, a partir de ésta se logran reproducir  
algunas proteínas virales o el genoma  
completo. Para la replicación de virus  
fitopatógenos se debe tener en cuenta el tipo  
de planta hospedera que se ha de utilizar, así  
como el tipo de vector, ya que algunos virus  
tienen una alta afinidad por esos hospederos y  
vectores (Chen et al., 2010). La clonación  
molecular es una de las herramientas de mayor  
utilidad en ingeniería genética y demás áreas  
afines, ya que ha facilitado el análisis de  
cualquier genoma. La finalidad de esta técnica  
es la de producir grandes cantidades del  
genoma viral; la estrategia básica de la  
clonación consiste en transferir un gen o una  
región específica de un organismo a otro para  
observar su expresión en el organismo receptor  
Métodos de secuenciación  
Mediante la secuenciación se puede obtener  
el orden exacto de monómeros, tanto de  
proteínas, como de ácidos nucleicos, con esto  
se puede secuenciar las proteínas de la cápside  
de un virus, así como también el genoma  
completo del virus (Kashina et al., 2005).  
Mediante esta técnica se pueden realizar  
comparaciones del genoma, lo cual permite  
ubicar y obtener la filogenia de una especie, en  
este caso, de un virus. La secuenciación se lleva  
a cabo siguiendo un proceso similar al de PCR,  
el cual se programa a varios ciclos, los cuales  
incluyen desnaturalización, hibridación y  
elongación. La reacción se lleva a cabo en un  
tubo de PCR, el cual debe contener  
amortiguadores e iniciadores altamente  
específicos para la región que se desee  
secuenciar; una vez obtenida la secuencia de  
(
Madigan et al., 2003). El proceso de clonación  
in vitro puede llevarse a cabo en varias etapas:  
primero, se hace el aislamiento y la  
fragmentación del ADN del organismo de  
interés, éste puede estar combinado con elADN  
de otro organismo, que con la ayuda de los  
primers específicos en un proceso de PCR, se  
logra obtener una gran cantidad de ADN del  
organismo blanco. Posteriormente, se hace la  
unión de los fragmentos del ADN amplificado  
en un vector de clonación; estos vectores están  
generalmente diseñados para permitir la  
recombinación del ADN foráneo en un sitio de  
restricción que corta al vector sin afectar su  
replicación; como parte final del proceso de  
clonación, se hace la introducción y  
mantenimiento de un organismo receptor, en el  
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LORETO ROBLES-HERNÁNDEZ, LUIS CARLOS CHAVIRA-SÁENZ, MARÍA TERESA SÁENZ-GUTIÉRREZ Y ANA CECILIA GONZÁLEZ-FRANCO:  
Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
nucleótidos, se hace uso de bases de datos  
bancos genéticos) para comparar la secuencia  
de nucleótidos con las de otros organismos  
Kashina et al., 2007). Existen algunos métodos  
existir para deducir si existe una secuencia en  
común con las otras especies (Yazdi et al.,  
2008; Kerlan et al., 2011).  
(
(
Conclusiones  
altamente sensibles que permiten una  
secuenciación eficaz y que han sido utilizados  
en múltiples investigaciones. Uno de los  
métodos es el de Maxam y Gilbert, en el que se  
determina la secuencia de una molécula deADN  
utilizando productos químicos que cortan en  
posiciones específicas los fragmentos  
marcados en sus extremos 5´. El segundo  
método es el de Sanger, en donde se utiliza un  
templete de ADN de cadena sencilla, para  
sintetizar la hebra complementaria, la cual se  
utiliza en posiciones específicas. En ambos  
métodos, la secuencia de la molécula se  
determina por diferencia en los tamaños de los  
fragmentos generados (Maxam y Gilbert, 1977;  
Sanger et al., 1977).  
La identificación y caracterización de Beet  
curly top virus implica un trabajo a profundidad,  
pues se tiene que iniciar desde su taxonomía,  
su importancia agrícola, su identificación  
mediante el uso de diversas técnicas  
serológicas y moleculares, así como su  
clonación, secuenciación y análisis filogenético  
a través de métodos modernos y de vanguardia.  
La información revisada y analizada en este  
documento muestra una panorámica general en  
trabajos con Curtovirus para técnicos e  
investigadores interesados en iniciar estudios  
que permitan aplicar las técnicas descritas en  
este documento para la identificación y  
caracterización de estos virus. Dicha  
información muestra el potencial para escalar  
a otros niveles de investigación que involucren  
estudios de las diversas proteínas que contiene  
el genoma, así como la relación que existe entre  
las especies de este virus con los vectores y  
sus hospederos.  
Análisis filogenético  
De acuerdo con el Comité Internacional de  
Taxonomía de Virus (ICTV, siglas en inglés),  
para establecer una clasificación confiable se  
deben considerar aspectos como la  
organización del genoma, propiedades  
biológicas, rango de hospederos y el tipo de  
vector de diseminación. El análisis filogenético  
consiste en comparar la secuencia genómica  
del virus BCTV y así poder establecer la relación  
con otras especies de curtovirus (Fauquet et  
al., 2008; Yazdi et al., 2008). Para el análisis  
filogenético, una vez que se obtiene la secuencia  
completa del genoma, se hace uso de bases  
de datos creadas por organizaciones  
especializadas que son de libre acceso y  
altamente confiables. Dichas organizaciones se  
encuentran en una constante actualización,  
recabando información de todas partes del  
mundo; estas bases de datos proporcionan la  
relación que hay con otras especies mediante  
porcentajes de similitud, número se secuencias  
iguales, entre otras. Existen varias metodologías  
para realizar el análisis filogenético con la  
secuencia de otros virus del mismo género, y  
así ver las similitudes y diferencias que puedan  
Literatura citada  
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Academic Press. USA. 922 p.  
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of complementary sense genes in Spinach curly top virus and  
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Vol. VIII, Núm. 1 • Enero-Abril 2014 •  
LORETO ROBLES-HERNÁNDEZ, LUIS CARLOS CHAVIRA-SÁENZ, MARÍA TERESA SÁENZ-GUTIÉRREZ Y ANA CECILIA GONZÁLEZ-FRANCO:  
Técnicas serológicas y moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus  
FAUQUET, C.M., R.W. Briddon, J.K. Brown, E. Moriones, J. Stanley,  
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Este artículo es citado así:  
Robles-Hernández, L., L. C. Chavira-Sáenz, M.T. Sáenz-Gutiérrez yA. C. González-Franco. 2014. Técnicas serológicas y  
moleculares utilizadas para la identificación y caracterización de Beet curly top virus. TECNOCIENCIA Chihuahua 8(1): 7-16.  
Resumen curricular del autor y coautores  
LORETO ROBLES HERNÁNDEZ: Título de Ingeniero Fruticultor (1992) y grado de Maestro en Ciencias de la Productividad Frutícola (1998) por  
la Universidad Autónoma de Chihuahua y grado de Doctor en Fitopatología (2004) por la Universidad de Idaho, USA. Es profesor  
investigador en la Universidad Autónoma de Chihuahua. Realiza investigación en el estudio de enfermedades de cultivos hortícolas.  
Imparte los cursos de Fitopatología, Microbiología, Control Biológico y Fisiología y Tecnología de Poscosecha. Ha realizado varios  
proyectos de investigación con financiamiento externo. Ha dirigido y concluido varias tesis de maestría y licenciatura. Ha publicado  
varios capítulos de libros, artículos científicos y resúmenes en memorias de congresos nacionales e internacionales. Es miembro del  
Sistema Nacional de Investigadores (S.N.I.), cuenta con el nombramiento de Perfil Deseable por la SEP-PROMEP y tiene dos primeros  
lugares por la presentación de los mejores trabajos de investigación, otorgados por la Sociedad Mexicana de Fitopatología y la  
Asociación Mexicana de Microbiología, respectivamente. Es responsable del área de diagnóstico de enfermedades de plantas en el  
laboratorio de Microbiología Aplicada, Fitopatología y Fisiología de Poscosecha en La Facultad de Ciencias Agrotecnológicas.  
ANA CECILIA GONZÁLEZ FRANCO: Título de Químico Bacteriólogo Parasitólogo en 1992 y grado de Maestro en Ciencias de la Productividad  
Frutícola en 1995 por la Universidad Autónoma de Chihuahua. Obtuvo su Doctorado en Microbiología, Biología Molecular y Bioquímica  
(
2004) en la Universidad de Idaho, USA. Es profesor investigador en la Universidad Autónoma de Chihuahua. Realiza investigación en  
el Control Biológico de Enfermedades y en la Interacción-Microorganismo-Planta. Imparte las cátedras de Interacción-Microorganismo-  
Planta, Bioquímica, Química y Biotecnología. Ha realizado varios proyectos de investigación con financiamiento externo. Ha dirigido  
y concluido varias tesis de maestría y licenciatura. Ha publicado varios artículos científicos y resúmenes en memorias de congresos  
nacionales e internacionales. Cuenta con el nombramiento de Perfil Deseable por la SEP-PROMEP y tiene dos primeros lugares por  
la presentación de los mejores trabajos de investigación, otorgados por la Sociedad Mexicana de Fitopatología y la Asociación  
Mexicana de Microbiología, respectivamente.  
LUIS CARLOS CHAVIRA SÁENZ: Título de Químico Bacteriólogo Parasitólogo en el 2008 con mención especial por la Universidad Autónoma  
de Chihuahua. Realizó su tesis para obtener el título de licenciatura titulada "Efecto antimicrobiano del aceite esencial de orégano  
Lippia berlandieri en bacterias patógenas del tracto respiratorio superior. Publicación del abstract "Antimicrobial Effect of Mexican  
Oregano (Lippia berlandieri) Essential Oil Against Upper Respiratory-Tract Pathogenic Bacteria" en la American Society For Microbiology.  
Ha participado en Jornadas de investigación en la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua.  
Actualmente cursa la Maestría en Ciencias de la Productividad Frutícola, Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, Universidad Autónoma  
de Chihuahua con el tema de investigación titulado, Identificación y caracterización del Beet curly top virus en cultivos hortícola de  
interés económico para el estado de Chihuahua.  
MARÍA TERESA SÁENZ GUTIÉRREZ. Es profesora investigadora de la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de  
Chihuahua. Obtuvo su maestría y licenciatura en la Universidad Autónoma de Chihuahua. Actualmente conduce su investigación sobre  
Manejo Integrado de Plagas, y Estudios de Efectividad Biológica de Insecticidas. Imparte las materias de Entomología, Manejo  
Integrado de Plagas y Uso y Manejo de Insecticidas. Asesora estudiantes tanto de la licenciatura en Ingeniero en Producción y  
Comercialización Hortícola como en la Maestría en Ciencias de la Productividad Frutícola. Es responsable del Laboratorio de  
Entomología y Manejo Integrado de Plagas de la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, Campus Cuauhtémoc.  
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