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Alimentos Artículo arbitrado
Resumen
La adición de IGF-I a los medios de fertilización in vitro y cultivo
de embriones ha sido propuesta como una forma de imitar las
señales maternas de la gestación temprana en el útero. El objetivo
del presente estudio fue evaluar la adición del factor de
crecimiento similar a la insulina tipo-I (IGF-I) sobre la tasa de
fertilización con semen sexado (SS) y de blastocistos bovinos
producidos in vitro, así como la calidad embrionaria. Se utilizó SS
de tres toros Holstein para la fertilización in vitro (FIV) de ovocitos
obtenidos de ovarios recolectados en rastro, para lo cual se
agregó IGF-I (100 ng/ml) en los medios de fertilización y desarrollo
embrionario a diferentes tiempos: T1 (IGF-I, d 0-7; n= 393); T2
(IGF-I, d 0-3; n= 394); T3 (IGF-I, d 3-7; n= 394); y T4 (sin IGF-I o
grupo control; n= 394). Se evaluó el porcentaje de fertilización al
día tres de incubación y el día siete se evaluó la calidad y estadio
de los blastocistos. Los datos se analizaron con el procedimiento
CATMOD de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC), ajustando un modelo
que incluyó el efecto de tratamiento (con y sin IGF-I, para tasa
de fertilización; y T1, T2, T3 y T4 para otras variables). La adición
de IGF-I al medio afectó la tasa de fertilización (34 vs 42%; P <
0.05) y no hubo efecto (P > 0.05) de tratamiento para la tasa de
blastocistos/ovocitos fertilizados, ni para calidad de los
blastocistos. Se concluye que bajo las condiciones del presente
estudio, la adición de IGF-I a los medios de fertilización y cultivo
in vitro no tiene un efecto benéfico para la producción de
embriones, pero sí afecta la fertilidad del semen sexado.
Palabras clave: IGF-I, embriones, fertilización in vitro, semen
sexado.
Abstract
The addition of IGF-I to the in vitro fertilization and embryo culture
media has been suggested as a means to imitate maternal signals
during early gestation in the uterus. The aim of the present study
was to evaluate the addition of insulin-like growth factor I (IGF-
I) on the fertilization rate with sexed semen (SS) and bovine
blastocysts produced in vitro as well as the embryo quality.
Semen used was from three Holstein bulls for in vitro fertilization
and oocytes were obtained from ovaries collected on a
slaughterhouse. For which IGF-I (100 ng/ml) was added in the
means of fertilization and embryo development at different times:
T1 (IGF-I, d 0-7; n= 393); T2 (IGF-I, d 0-3; n= 394); T3 (IGF-I, d 3-
7; n= 394); and T4 (without IGF-I or control group; n= 394).
Fertilization rate was evaluated at day 3 of incubation, and at
day 7, blastocysts quality and stage were assessed. Data were
analyzed with CATMOD of SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC),
adjusting a model including the effect of treatment (with and
without IGF-I, for fertilization rate; and T1, T2, T3 and T4, for
other variables). The addition of IGF-I to the media affected the
fertilization rate (34 vs 42%; P < 0.05) and there was not effect
(P > 0.05) of treatment for the rate blastocysts/fertilized oocytes
fertilized or for the quality of blastocysts. It is concluded that
under the conditions of this study, with the use of sexed semen,
the addition of IGF-I to the media of fertilization and culture in
vitro does not have a beneficial effect on the production of
embryos, but it does affect the fertility of the sexed semen.
Keywords: IGF-I, embryo, in vitro fertilization, sexed semen.
Fertilization rate, development and quality of Holstein bovine embryos
produced in vitro with sexed semen and addition of IGF-I
OCTAVIO MARTÍNEZ-GUERRERO1, JAVIER ANTILLÓN-RUÍZ1,2, FELIPE ALONSO
RODRÍGUEZ-ALMEIDA1
_________________________________
1 Facultad de Zootecnia y Ecología, Universidad Autónoma de Chihuahua. Periférico Francisco R. Almada, Km 1 de la Carretera
Chihuahua-Cuauhtémoc. Chihuahua, Chih., México, 31031. Tel (614) 434-0303.
2 Dirección electrónica del autor de correspondencia: jantillon@uach.mx.
Recibido: Noviembre 19, 2015 Aceptado: Marzo 15, 2016
Tasa de fertilización, desarrollo y calidad de
embriones bovinos Holstein producidos in
vitro con semen sexado y adición de IGF-I
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En los establos lecheros, la obtención de crías hembras es prioridad respecto a los
machos, dado el objetivo de la producción de leche. El uso de semen sexado (SS)
es una alternativa disponible para tal fin; sin embargo, la fertilidad de dicho semen
es menor (20 - 40%) al no sexado cuando se utiliza mediante inseminación artificial (IA);
Seidel Jr. et al., 1999). Afortunadamente, la producción in vitro (PIV) de embriones es una
forma eficiente de utilizar el SS para lograr más embriones hembra (Rasmussen et al., 2013).
Introducción
En diversos estudios (Tonello et al., 2005;
Xu et al., 2009) se reportan tasas de
blastocistos producidos in vitro mediante el uso
de SS superiores al 30%. No obstante, la
calidad de dichos embriones es inferior a la de
los embriones producidos in vivo, en términos
de morfología, metabolismo, expresión génica
y criotolerancia (Rizos et al., 2008). Mediante la
PIV, alrededor de 90% de los ovocitos maduran,
mientras que 80% logra la fertilización y
segmentación; sin embargo, únicamente 30 a
40% de los ovocitos inmaduros se convierten
en blastocistos a los 7 a 8 d pos-fertilización
(Lonergan, 2007). Así mismo, cuando la PIV de
embriones se hace con SS (Cran et al., 1993),
la tasa de éxito es menor que cuando se usa
semen convencional (Xu et al., 2009). Además,
hay reportes que indican que los embriones PIV
con SS disminuyen su competencia para lograr
una gestación debido a alteraciones tanto
ultraestructurales (Palma et al., 2008) como del
RNAm en genes importantes para su desarrollo,
como los que intervienen en la glucólisis (Morton
et al., 2007); aunque previamente Xu et al.
(2006) indicaron que no había diferencia en la
tasa de gestación obtenida con embriones PIV
con SS y semen no sexado.
Una forma de optimizar la PIV de embriones
es imitando las señales maternas de la
gestación a través del medio de cultivo
embrionario (Gopichandran y Leese, 2006; Vajta
et al., 2008). Esto puede lograrse a través de
factores como IGF-I (Lima et al., 2006; Loureiro
et al., 2009), cuya expresión se ha observado
en útero, oviducto y en el mismo embrión
(Velázquez et al., 2008). Bonilla et al. (2011a)
demostraron que su adición en la PIV de
embriones incrementa la tasa de ovocitos que
se convierten en blastocistos, lo cual se atribuye
a sus propiedades anti-estrés (Jousan y
Hansen, 2007) y antioxidantes (Bonilla et al.,
2011b). Sin embargo, se desconoce su efecto
en embriones generados con SS, por lo que, el
objetivo del presente estudio fue evaluar las
tasas de fertilización de ovocitos, porcentaje de
blastocistos y calidad de embriones de bovino
PIV utilizando SS y agregando IGF-I a los medios
de cultivo.
Materiales y métodos
Producción de embriones in vitro
Preparación del IGF-I.
Se preparó la solución stock para IGF-I
recombinante humano (Sigma, I1271) con 1 mg/
ml añadiendo 10 mM de HCL (ácido clorhídrico).
Se almacenó a –20 °C en alícuotas de 10 l. La
concentración de IGF-I adicionada en los medios
de fertilización y desarrollo embrionario (100 ng/
ml) se basó de los valores encontrados en
sangre de vacas lecheras (Falkenberg et al.,
2008; Wu et al., 2010) y estudios in vitro
realizados por Bonilla et al. (2011a).
Colección y maduración de ovocitos.
Se usaron ovarios de vacas Holstein
colectados de un rastro tipo inspección federal
(TIF), los cuales fueron transportados al
laboratorio en solución salina estéril (0.15 M) a
temperatura ambiente. Los complejos ovocito-
cúmulus (COCs) fueron aspirados de folículos
antrales de 2 a 8 mm de diámetro; se
seleccionaron ovocitos con más de tres capas
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calidad de embriones bovinos Holstein producidos in vitro con semen sexado y adición de IGF-I
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de células cumulares compactas y citoplasma
homogéneamente granulado. Los COCs se
lavaron en medio químicamente definido (CDM,
por sus siglas en inglés), amortiguado con
Hepes y luego con medio de maduración (CDM-
M; De la Torre-Sánchez et al., 2006). Cincuenta
COCs fueron madurados en platos de cuatro
pocillos (Nunclon, Roskilde, Denmark),
conteniendo 1 ml de CDM-M con 0.5% FAF-BSA
(Sigma, A-6003), 15 ng/ml de FSH (NIH-FSH-
S17; NIH, Bethesda, MD), 2 μg/ml de estradiol-
17 (Sigma, E-2257), 50 ng/ml EGF (Sigma, E-
9644) y 0.1 mM cisteamina. Finalmente, estos
fueron incubados a 38.5 °C con 5% de CO2 en
aire por 23 h.
Preparación del semen sexado.
Se utilizó semen de 3 sementales Holstein
para este estudio. Las pajillas (0.25 ml)
contenían ~2 x 106 de células espermáticas y
se descongelaron en baño maría a 35 °C por
30 s. Posteriormente, se vertió en la parte
superior de un gradiente de Percoll (P-1644,
Sigma) con 2 ml al 90% y 2 ml al 45% en medio
Sperm-TALP (Tryode’s modificado; Parrish et
al., 1989), para ser centrifugado por 20 min a
1300 rpm. El pellet espermático (50 μl de SS)
resultante fue lavado con 4.5 ml de medio para
fertilización (F-CDM; De La Torre-Sánchez et
al., 2006) suplementado con 0.5% BSA, 5 mM
cafeína (C-0750, Sigma) y 2 μg/ml de heparina
(H-3125, Sigma). La muestra fue centrifugada
nuevamente por 5 min a 1300 rpm y el
sobrenadante fue descartado, quedando
aproximadamente 50 μl de SS; se tomó una
muestra de 2 μl para determinar la
concentración espermática con la cámara de
Neubauer. La concentración final fue de 4x106
espermatozoides/ml.
Fertilización in vitro.
El total de COCs madurados se dividió en
dos tratamientos (IGF-1 y control).
Posteriormente, en grupos de 30, los COCs
fueron adicionados en microgotas de 55 ml con
medio F-CDM o F-CDM/IGF-1 (100 ng/ml de
IGF-I) y cubiertas con aceite mineral en una caja
de petri. Después, se adicionaron 20 ml de la
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calidad de embriones bovinos Holstein producidos in vitro con semen sexado y adición de IGF-I
suspensión espermática, con una concentra-
ción final de 4 x 106 espermatozoides/ml. Los
gametos fueron co-incubados durante la noche
(18 ± 1 h) a 38.5 °C con 5% de CO2 en aire.
Posteriormente, los COCs fueron vigorosa-
mente agitados en un volumen de 100 ml de
medio por 1 min para remover las células
cumulares.
Cultivo in vitro de embriones.
Los presuntos cigotos fueron enjuagados
en H-CDM-1 (Hepes CDM + Aminoácidos no
esenciales, 10 mM EDTA, 0.5% FAF – BSA, 0.5
mM fructosa) y cultivados en CDM-1 ó CDM-1/
IGF-1 (100 ng/ml de IGF-1) por 56 h en 5% CO2,
5% O2, 90% N2 a 38.5 °C. Después de 56 a 60
h, los embriones de más de ocho células se
enjuagaron en H-CDM-2 (Hepes CDM-1 sin
EDTA pero con aminoácidos esenciales y no
esenciales y 2 mM de fructosa). Finalmente, se
cultivaron en CDM-2 o CDM-2/IGF-1 (100 ng/
ml de IGF-1) por 4 d.
Evaluación de embriones.
Al día tres, solo embriones de ocho o más
células se siguieron cultivando, los demás se
descartaron. Para blastocistos, el día siete se
evaluó la calidad y estadio embrionario en base
al código de la Sociedad Internacional de
Transferencia de Embriones (IETS, 1998).
Diseño experimental.
Se realizaron 8 corridas (repeticiones) de
PIV de embriones en las que se evaluó el efecto
de la adición del IGF-I sobre la tasa de FIV con
SS, la producción de blastocistos y su calidad.
Para las variables de producción de blastocistos
y su calidad, se tuvieron cuatro tratamientos de
acuerdo al día de desarrollo embrionario en que
se adicionó el IGF-I: T1 (IGF-I, 0-7 d; n= 393);
T2 (IGF-I, 0-3 d; n= 394); T3 (IGF-I, 3-7 d; n=394)
y T4 (sin IGF-I o grupo control; n= 394). Para
este estudio se utilizaron un total de 1,575
ovocitos distribuidos entre los cuatro
tratamientos descritos con anterioridad.
Análisis estadístico.
Los datos para porcentaje de fertilización,
blastocistos y calidad de los mismos, fueron
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analizados mediante técnicas de análisis de
datos categóricos con el procedimiento
CATMOD de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). El
modelo ajustado incluyó los factores de
tratamiento (con y sin IGF-I, para tasa de
fertilización; y T1, T2, T3 y T4, para las otras
variables). El efecto de semental no fue evaluado
debido a la poca disponibilidad de semen que
impidió se usaran los tres toros para la
fertilización in vitro en cada corrida.
Resultados y discusión
Producción de embriones in vitro.
Evaluación de la tasa de fertilización. De
acuerdo al análisis realizado, el tratamiento con
IGF-I (34.3%) afectó la tasa de fertilización (P <
0.05) en comparación con el grupo sin IGF-I
(41.5%) al momento de la FIV (Figura 1).
Figura 1. Tasa de fertilización por tratamiento (IGF-1, adicionado
con 100 ng/ ml; SIN, grupo control).
a,b Literales diferentes entre tratamientos denotan diferencia
estadística (P < 0.05).
La concentración del IGF-I en plasma
seminal bovino es de 116 a 144 ng/ml (Henricks
et al., 1998; Hoeflich et al., 1999). La baja
calidad seminal encontrada en toros con
deficiente desempeño reproductivo es asociada
con niveles significativamente anormales (194
± 26 ng/ml) (Hoeflich et al., 1999). Estos
hallazgos sugieren que el IGF-I puede regular
la función del espermatozoide al momento de
la fertilización (Selvaraju et al., 2009). Sin
embargo, su funcionalidad depende de la
presencia del receptor (IGF-IR) en el acrosoma
y de proteínas de enlace (IGFBPs), las cuales
no están disponibles en los sistemas in vitro,
con lo cual se estima que la ausencia de dichas
proteínas limitó la capacidad fertilizante de los
espermatozoides al momento de la fecundación,
ya que en condiciones in vivo los eventos de
pre-fertilización en el aparato reproductivo de la
hembra están regulados por una interacción
entre IGF-I oviductual y los receptores del IGF-I
en el acrosoma del espermatozoide (Suarez,
1997). Así lo indicaron Mahmoud y Parrish
(1996), quienes reportaron que los factores
solubles oviductuales mejoran la capacitación
del espermatozoide bovino; por lo tanto, el IGF-I
en el aparato reproductivo de la hembra
interviene en el desempeño espermático al
momento de fertilizar el ovocito y en lograr la
fertilización.
Existen diversas diferencias entre toros
sobre la habilidad de los espermatozoides para
fertilizar ovocitos a través de FIV (Shi et al., 1990;
Lonergan, 1994). Como se discutió anterior-
mente, toros con baja fertilidad tienen niveles
elevados de IGF-I en plasma seminal; sin
embargo, en condiciones in vitro, Dahli et al.
(2009) llevaron a cabo un experimento utilizando
IGF-I en semen de toros con alto y bajo rango
de fertilidad; los resultados obtenidos mostraron
que cuando el nivel de IGF-I es estandarizado
en 100 ng/ml, el porcentaje de fecundación de
los sementales con baja fertilidad es similar al
de los toros con alta fertilidad (67.7 vs 66.4%,
respectivamente), logrando así demostrar que
el IGF-I mejora el desempeño de los
espermatozoides con sementales de baja
fertilidad. Aunque, estos resultados difieren de
los encontrados en nuestro estudio, ya que
cuando se utilizó IGF-I al momento de la
fertilización se perjudicó la fertilización.
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calidad de embriones bovinos Holstein producidos in vitro con semen sexado y adición de IGF-I
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Dicho hallazgo podría deberse también a
que el IGF-I alteró la funcionalidad del ovocito,
ya que Hashizume et al. (2000) y Stevenson y
Whates (1996) afirman que los receptores para
IGF-I son detectados en células de la granulosa
en el ovario, en epitelio secretor del oviducto y
en glándulas endometriales del útero de
hembras no gestantes. Lo que hace suponer
que el IGF-I mantiene un efecto regulador en la
fertilización del ovocito; aunque por otra parte,
Sirisathien et al. (2003) afirman que el IGF-I no
tiene efecto sobre la fertilización o en estadios
tempranos del embrión.
El uso de SS en programas de FIV es
asociado a una alta variabilidad de los
resultados, dependientes en gran medida del
semental (Barceló-Fimbres y Seidel Jr, 2007),
así como del desarrollo embrionario posterior
(Ward et al., 2003). Los resultados obtenidos
en este estudio para la tasa de fertilización con
SS son similares a lo alcanzado por Tonello et
al. (2005), pero inferiores a los reportados por
Cebrian-Serrano et al. (2013) y Rasmussen et
al. (2013); posiblemente, esto sea debido a que
ellos utilizaron ovocitos aspirados in vivo a
través de punción ovárica (OPU por sus siglas
en inglés), los cuales tienen mayor competencia
en lograr la fertilización que ovocitos prove-
nientes de vacas enviadas a rastro (Dahli et al.,
2009), pues dichos animales presentan un sin
número de problemas reproductivos, razón por
la cual se determina el fin de su vida productiva.
Evaluación de la tasa de blastocistos. No
se encontró diferencia (P > 0.05) entre
tratamientos para la tasa de ovocitos fertilizados
que alcanzaron el estadio de blastocisto con SS.
Estos resultados se presentan en la Figura 2;
El porcentaje de ovocitos que llegaron al estadio
de blastocisto, contrasta con lo reportado por
Sirisathien et al. (2003), quienes mostraron que
el IGF-I a 10 y 50 ng/ml mejoraba la proporción
de embriones con 4 células que alcanzaban el
estadio de blastocisto cuando eran comparados
con el grupo control (54.4, 64.2 y 39.3%,
respectivamente). Aunado a esto, Bonilla et al.
(2011a) obtuvieron una mayor tasa de
blastocistos (~30%) cuando adicionaban IGF-I
(100 ng/ml) el día 3 pos-fertilización, aunque en
el presente estudio se utilizó SS, el cual tiene
menor tasa de fertilidad. Estos mismos autores
afirman que este efecto favorable en el
desarrollo embrionario es debido a la activación
de rutas proteicas, tales como la proteína MAPK,
cuya función está mediada por IGF-I y participa
en eventos claves como proliferación celular y
bloqueo de la apoptosis (Jousan y Hansen,
2007), incluyendo disminución del estrés, tanto
calórico (Jousan et al., 2008) como oxidativo
(Bonilla et al., 2011b).
Figura 2. Tasa de blastocistos/ ovocitos fertilizados de acuerdo
al día de adición de IGF-I al medio de cultivo embrionario.
a Literal similar entre tratamientos denota que no hubo diferencia
estadística (P > 0.05).
El IGF-I aumenta la tasa de blastocistos
debido a que regula eventos claves asociados
con el genoma embrionario (Bonilla et al.,
2011a), por lo tanto, la falta de desarrollo
embrionario en etapas tempranas (primeros 3
días pos-fertilización) puede ser atribuida a que
el embrión aún no tiene formado ni activado su
propio genoma (Memili y First, 2000) y se
encuentra regulando sus procesos vitales a
través del genoma materno; aunque en nuestro
análisis para ovocitos que se convierten en
blastocistos no existió diferencia significativa
entre tratamientos, hubo una tendencia
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numérica negativa en el T2 (IGF-I, 0-3d), de tal
manera que el retiro del IGF-I para etapas
posteriores del desarrollo embrionario tendió a
limitar la capacidad del embrión para
convertirse en blastocisto.
Evaluación de la calidad embrionaria. Los
resultados obtenidos para calidad embrionaria
de acuerdo a los embriones que alcanzaron la
calidad 1 y 2 (IETS; 1998) (Figura. 3) muestran
que no hubo diferencia entre tratamientos (P >
0.05).
Figura 3. Tasa de blastocistos con calidad 1 y 2 por tratamiento.
a Literal igual entre tratamientos denota que no hubo diferencia
estadística (P > 0.05).
Loureiro et al. (2009) reportaron una tasa
de blastocistos viables para transferencia del
18%, cuando estos fueron desarrollados con
IGF-I y fertilizados con SS; estos resultados no
coinciden con los alcanzados en este estudio
(6.1%); tampoco concuerdan con la tasa de
11.7% obtenida por Cebrian-Serrano et al.
(2013), ni con el 13% de Rasmussen et al.
(2013); sin embargo, estos últimos no utilizaron
IGF-I en sus medios de cultivo embrionario. En
este sentido, Block y Hansen (2007) lograron
una tasa de blastocistos transferibles fertilizados
con semen convencional del 14.7% cuando
utilizaban IGF-I en el medio de cultivo.
Conclusión
Bajo las condiciones del presente estudio,
se concluye que la adición de IGF-I a los medios
de fertilización y cultivo in vitro no tiene un efecto
benéfico para la producción de embriones, pero
sí afecta la fertilidad del semen sexado.
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Este artículo es citado así:
Martínez-Guerrero, O. J. Antillón-Ruíz, F. A. Rodríguez-Almeida. 2015. Tasa de fertilización, desarrollo y calidad de
embriones bovinos Holstein producidos in vitro con semen sexado y adición de IGF-I. TECNOCIENCIA Chihuahua 9(3):
140-147.
Resumen curricular del autor y coautores
OCTAVIO MARTÍNEZ GUERRERO. Obtuvo el título de Médico Veterinario Zootecnista en 2011 por la Unidad Académica de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Zacatecas. En 2015 logra el título de Maestro en Ciencias en el área de
Reproducción y Genética Animal por la Facultad de Zootecnia y Ecología de la Universidad Autónoma de Chihuahua. Desde 2015 a
la fecha, labora en el Comité Estatal para el Fomento y Protección Pecuaria de Zacatecas como Profesional Zoosanitario (Supervisor
Distrital).
JAVIER ANTILLÓN RUIZ. Obtuvo el título de Ingeniero Zootecnista en Sistemas de Producción en el 2008 y el grado de Maestría en
Ciencias en el área de Reproducción y Genética Animal en el 2012 en la Facultad de Zootecnia y Ecología de la Universidad
Autónoma de Chihuahua. Desde el 2010 labora en esta Facultad y su área de especialización es la producción in vitro de embriones.
Es autor y coautor de tres artículos científicos y dos ponencias en congreso. Del año 2015 a la fecha, colabora como asesor del
centro de biotecnologías reproductivas de la Unión Ganadera Regional de Chihuahua.
FELIPE ALONSO RODRÍGUEZ ALMEIDA. Es Ingeniero Zootecnista (1988) y Maestro en Ciencias en Producción Animal, con área mayor en
Reproducción y Genética (1990), por la Universidad Autónoma de Chihuahua. Obtuvo su doctorado en la Universidad de Nebraska-
Lincoln (1994) en el área de Mejoramiento Animal, para lo cual realizó su disertación enfocada al desarrollo de modelos para la
evaluación genética de bovinos carne en poblaciones multirraciales. Su trabajo de investigación en México lo ha enfocado
principalmente al desarrollo de evaluaciones genéticas nacionales, el mantenimiento de la integridad de la membrana espermática
en semen criopreservado de ovino, la evaluación de cruzas para la producción de carne de ovino y bovino, con énfasis especial
en la eficiencia biológica y los factores que influyen en la misma, y la incorporación de la genética molecular y la genómica en los
programas de mejora genética de ovinos en México. Es autor y coautor de más de 40 artículos en revistas indizadas y arbitradas,
tres capítulos en libro, y más de 60 trabajos presentados en congresos nacionales e internacionales. Se ha desempeñado como
académico en la Facultad de Zootecnia y Ecología de la Universidad Autónoma de Chihuahua desde 1990 y ha sido Miembro del
Sistema Nacional de Investigadores desde 1993 (Candidato 1993-1996, Nivel I 1996-2002, 2008-2018).
