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• Vol. XIII, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2019 •
Comparación de la eficiencia de transformación
entre diferentes cepas de E. coli
Comparison of transformation efficiency in different
E. coli strains
S
AMANTHA
Y
OLOTZIN
G
ARCÍA
-C
ÁRDENAS
1,2
, D
ANIELA
G
RISSEL
R
UVALCABA
-H
IDROGO
1,2
, C
ARMEN
C
AROLINA
A
LVARADO
-G
ONZÁLEZ
1,2
, M
ARÍA
G
EORGINA
G
ÓMEZ
-F
IERRO
1,2
, Ó
SCAR
E
NRIQUE
J
UÁREZ
-
A
COSTA
1,2
, M
AYELA
R
OSARIO
E
SPINOZA
-D
UARTE
1,2
, G
ERARDO
P
ÁVEL
E
SPINO
-S
OLÍS
1,2,3
Recibido: Diciembre 18, 2018
Aceptado: Mayo 23, 2019
Resumen
La transformación es la introducción y expresión de ADN exógeno por
células bacterianas. La eficiencia de la transformación puede medirse en
unidades formadoras de colonia/ml (UFC/ml) y es susceptible al método
utilizado, a la cepa bacteriana utilizada para la expresión y al propio
vector. En este trabajo se busca evaluar las diferencias en la eficiencia de
transformación de dos plasmidos de expresión (pExp-Lib y pSF-CMV-
Ub-puro-SV40 Ori Sbfl), en cuatro cepas diferentes de
E. coli
(DH5
,
BL21, XL1-Blue y TG1) utilizando un método de preparación de células
competentes basado en el uso de MgCl2/CaCl2. En todas las cepas
utilizadas, el crecimiento bacteriano y la eficiencia de transformación
fueron mayores para las cepas con el vector pExp, a excepción de BL21,
donde la eficiencia fue más elevada para el vector pSF.
Palabras clave:
E. coli
, transformación, choque térmico, método MgCl
2
/
CaCl2.
Abstract
Transformation is the introduction and expression of exogenous
DNA by bacterial cells. Transformation efficiency can be measured in
colony forming units/ml (CFU/ml) and is susceptible to the method
used, the bacterial strain used for expression and the vector itself. In
this work we seek to evaluate the differences in the transformation
efficiency of two expression plasmids (pExp-Lib and pSF-CMV- Ub-
puro-SV40 Ori Sbfl), in four different E. coli strains (DH5
, BL21,
XL1-Blue and TG1) using a competent cell preparation method
based on the use of
MgCl2/CaCl2
. In all strains used, bacterial
growth and transformation efficiency were higher for strains with
the pExp vector, with the exception of BL21, where efficiency was
higher for the pSF vector.
Keywords: E. coli, transformation, thermal shock,
MgCl
2
/
CaCl2
method.
_________________________________
1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA. FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOMÉDICAS. LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN TRASLACIONAL. CIRCUITO UNIVERSITARIO
31109, CAMPUS II UACH, CHIHUAHUA, CHIH. TEL. (614) 461-8314.
2
U
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B
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ACIONAL DE
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NIVERSITARIO
31109, C
AMPUS
II UACH, C
HIHUAHUA
, C
HIH
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EL
. (614) 461-8314.
3 DIRECCIÓN ELECTRÓNICA DEL AUTOR DE CORRESPONDENCIA: GESPINOS@UACH.MX
Salud Artículo arbitrado
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SAMANTHA T. GARCÍA-CÁRDENAS, DANIELA G. RUVALCABA-HIDROGO, CARMEN C. ALVARADO-GONZÁLEZ, MARÍA G. GÓMEZ-FIERRO, ÓSCAR E. JUÁREZ-
ACOSTA, MAYELA R. ESPINOZA-DUARTE, GERARDO P. ESPINO-SOLÍS: Comparación de la eficiencia de transformación entre diferentes cepas de E. coli
L
Introducción
a bacteria Escherichia coli (E. coli) fue descrita y aislada por primera vez en 1884 por
el microbiológo y pediatra alemán Theodor Escherich, él la llamó como Bacterium
coli commune debido a los estudios que realizaba con microorganismos en el intestino
de niños y su papel en la digestión (Blount, 2015).
En el siglo XX, en los inicios de los años 40, esta
bacteria comienza a ser empleada como modelo
experimental (Judson, 1996). En el presente, es posible
encontrar entre 10,000-18,000 cepas de E.coli de
acuerdo al The Escherichia Coli Genetic Stock Center
(http://cgsc2.biology.yale.edu) y American Type
Culture Collection (www.atcc.org).
La facilidad y económico que resulta trabajar con
esta bacteria, además de su versatilidad, han hecho de
ella un modelo experimental ampliamente usado
alrededor del mundo por diferentes empresas
biotecnológicas y grupos de investigación. Se estima
que en el año 2011 este modelo bacteriano aportó a la
economía global $ 500 mil millones de dólares (Bruschi
et al., 2011; Huang et al., 2012; Baeshen et al., 2015).
En genética, la transformación se define como la
introducción y expresión de ADN exógeno, natural o
diseñado genéticamente, por células bacterianas
(Chen y Dubnau, 2004; Roychoudhury et al., 2009).
Las células bacterianas que tienen la capacidad de
introducir y expresar ADN exógeno se conocen como
células competentes (Roychoudhury et al., 2009;
Blount, 2015; Kostylev et al., 2015). La transformación
puede llevarse a cabo de manera natural o por medios
artificiales en bacterias. La transformación natural se
da gracias a la presencia de proteínas en la superficie
exterior de las bacterias que pueden unirse al ADN y
transportarlo al interior de la célula. Este fenómeno se
da en diversos géneros de bacterias, como
Micrococcus, Haemophilus, Bacillus y Streptococcus
(Roychoudhury et al., 2009; Blount, 2015; Kostylev
et al., 2015). Sin embargo, ese tipo de transformación
raramente ocurre en la mayoría de las bacterias,
requiriendo de su inducción por métodos artificiales
(Chen y Dubnau, 2004; Yoshida y Sato, 2009; Chan et
al., 2013).
Uno de los métodos más utilizado y económico
de preparación de células competentes de E.coli es con
cloruro de calcio (CaCl2) y transformación por choque
térmico, reportado por Mendel y Higa en 1970
(Mandel y Higa, 1970). El proceso de transformación
genética consta de cuatro etapas: desarrollo de un
estado de competencia en la célula, unión de la molécula
de ADN a la superficie celular, su entrada y
procesamiento y, finalmente, la expresión fenotípica
del nuevo genotipo resultante (Hanahan, 1983;
Blount, 2015). El mecanismo exacto por el cual el
cloruro de calcio media el proceso de transformación
artificial sigue siendo una incógnita. Resultados
previos sugieren que el calcio facilita la adsorción del
ADN sobre la superficie celular y el choque térmico
permite la entrada del ADN adsorbido al citoplasma
de la célula (Sinha y Redfield, 2012; Choi et al., 2013;
Rahimzadeh et al., 2016; Liu et al., 2018).
La bacteria E. coli tiene características muy
atractivas, como un crecimiento acelerado, la
transformación rápida de ADN exógeno y la fácil
obtención de cultivos de alta densidad celular (Rosano
y Ceccarelli, 2014). Gracias a esta versatilidad,
diversos trabajos de investigación con E. coli han
llevado a muchos avances en una variedad de campos
como la biología molecular, fisiología y genética; se
puede mencionar la descripción del código genético
(Crick et al., 1961), replicación del ADN (Lehman et
al., 1958), transcripción (Blount, 2015), y el
descubrimiento de las enzimas de restricción (Linn y
Arber, 1968; Meselson y Yuan, 1968). En el campo
farmacéutico ha permitido la síntesis in vivo de
proteínas recombinantes terapéuticas como la
insulina (tratamiento de diabetes), interleucina 2
(melanoma metastásico), interferón beta humano
(esclerosis múltiple), taxol (cáncer), etc. (Kamionka,
2011; Huang et al., 2012; Baeshen et al., 2015). En
SAMANTHA T. GARCÍA-CÁRDENAS, DANIELA G. RUVALCABA-HIDROGO, CARMEN C. ALVARADO-GONZÁLEZ, MARÍA G. GÓMEZ-FIERRO, ÓSCAR E. JUÁREZ-
ACOSTA, MAYELA R. ESPINOZA-DUARTE, GERARDO P. ESPINO-SOLÍS: Comparación de la eficiencia de transformación entre diferentes cepas de E. coli
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• Vol. XIII, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2019 •
aplicaciones de ingeniería genética y biotecnología,
en este modelo bacteriano se han desarrollado técnicas
y tecnologías de ingeniería genética incluidas la
clonación molecular y ADN recombinante (Cohen et
al., 1972; Cohen et al., 1973). Esta bacteria ha sido
también utilizada para la producción de biocombus-
tibles (Liu y Khosla, 2010; Janssen y Steinbuchel,
2014), y químicos industriales como el fenol (Kim et
al., 2014) y etanol (Hildebrand et al., 2013).
La eficiencia de transformación se expresa
matemáticamente como el cociente del número total
de células bacterianas que expresan el marcador de
resistencia a antibiótico, y la cantidad de ADN que fue
utilizado en el experimento (Roychoudhury et al.,
2009). Esta eficiencia de transformación depende
directamente de la cepa bacteriana y plásmido
empleados. La cantidad de plásmidos se estima en
78,028 de acuerdo al repositorio de plásmidos
Addgene (https://www.addgene.org) y las secuencias
disponibles depositadas en la base de datos de NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov), es de 10,892
(Brooks et al., 2019), cada uno de ellos con caracte-
rísticas diferentes como: replicones, promotores,
marcadores, sitios de clonación múltiple, entre otras
(Rosano y Ceccarelli, 2014). La transformación de E.
coli con plásmidos por requisito incluye uno o varios
genes que proveen resistencia a antibióticos, se dice
que un procedimiento de tranformación es exitoso
cuando aparecen/crecen colonias aisladas en placas
con medio selectivo. Uno de los criterios utilizados
para evaluar este evento es la eficiencia de
transformación (Hanahan, 1983).
La introducción del ADN a la célula bacteriana no
es un proceso sencillo, en algunos casos utililizando
células competentes comerciales la eficiencia de
transformación alcanza entre 109-1010 UFC/g
(unidades formadoras de colonias/g de plásmido
empleado). Por esta razón, la transformación puede
ser considerada como el paso limitante en algunas
aplicaciones, como la construcción de librerías de ADN
y de expresión de genes (Aachmann y Aune, 2009).
Las cepas de E. coli DH5a y XL1-blue, permiten
hacer procedimientos de clonación y la selección con
el sistema azul/blanco con una interrupción en el gen
lacZM15, tienen alta estabilidad en los insertos debido
a una mutación en el gen recA1 y permiten una alta
producción y calidad de ADN por la mutación en endA.
Las células competentes XL-1 blue se utilizan para el
rescate de fagemido de una sola hebra de ADN y la
transformación del ADN metilado (Han et al., 2001;
Kostylev et al., 2015). La cepa BL21 (DE3) pLysS
permite la expresión de proteínas de alta eficiencia de
cualquier gen que esté bajo el control de un promotor
T7. La cepa transporta tanto el lisógeno DE3 como el
plásmido pLysS, que se expresa de forma constitutiva
niveles bajos de lisozima T7, que reduce la expresión
basal de genes recombinantes mediante la inhibición
de los niveles basales de ARN polimerasa T7. La alta
expresión de proteínas se logra mediante la adición
de IPTG (Isopropyl - D -1-thiogalactopyranoside)
(Jeong et al., 2015). Las células competentes TG1 son
el estándar de oro para el despliegue en fagos de
anticuerpos o la creación de bibliotecas de despliegue
de fagos de péptidos. Esta cepa se utiliza ampliamente
para crear bibliotecas más grandes y hacer métodos
de «screening» rápidos (Carmen y Jermutus, 2002;
Fryszczyn et al., 2011).
En este trabajo se está evaluando la compati-
bilidad de dos plásmidos con cuatro diferentes cepas
de E. coli: el interés en pEXP-Lib (pEXP) reside en la
versatilidad que presenta para ser empleado en la
construcción de librerías de cADN, por otra parte,
permite hacer librerías de expresión en células de
mamífero; debido a que contiene un casette de
restistencia puromicina, es posible seleccionar células
resistentes a este antibiótico, lo cual se traduce en la
obtención líneas celulares estables productoras de la
proteína de interés. El plásmido pSF-CMV-Ub-puro-
SV40 Ori Sbfl (pSF), contiene el origen de replicación
del virus de simio 40 (SV40), lo cual le permite
aumentar los niveles de expresión del gen de interés.
Este vector también se puede usar para forzar la
recombinación en el genoma de células de mamíferos
que no expresan el antígeno T grande de SV40 después
de la transfección y la selección de puromicina.
El enfoque de nuestro laboratorio es de
aplicaciones biotecnológicas y de investigación
traslacional, por lo que es de importancia optimizar el
procedimiento de transformación y hacerlo más
eficiente para impactar en la reducción de costos y
tiempo invertido. En este trabajo se analiza la
compatibilidad y eficiencia de transformación de dos
plásmidos (pExp-Lib y pSF-CMV-Ub-puro-SV40 Ori
Sbfl), en cuatro cepas diferentes de E. coli (DH5,
SAMANTHA T. GARCÍA-CÁRDENAS, DANIELA G. RUVALCABA-HIDROGO, CARMEN C. ALVARADO-GONZÁLEZ, MARÍA G. GÓMEZ-FIERRO, ÓSCAR E. JUÁREZ-
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BL21, XL1-Blue y TG1) utilizando un método de
preparación de células competentes modificado,
basado en el uso de MgCl2/CaCl2, con el racional de
aumentar la carga electrostatica en la superficie las
bacterias al aumentar la cantidad de iones y de esta
manera aumentar la adsorción de ADN exógeno.
Materiales y métodos
Lugar y año del estudio. El presente trabajo se
llevó a cabo en el periodo comprendido entre febrero
y agosto del año 2018 en el Laboratorio de
Investigación Traslacional y Laboratorio Nacional de
Citometría de Flujo, ubicados en la Facultad de
Medicina y Ciencias Biomédicas de la Universidad
Autónoma de Chihuahua (UACH).
Preparación de células quimiocompetentes. Se
estriaron las cuatro diferentes cepas bacterianas de
E. coli (DH5, BL21, TG1 y XL1-Blue) en placas Petri
con medio LB-agar (BD Ref. 244520) sin antibiótico
y se incubaron a 37 °C toda la noche. Se tomó una
colonia aislada para inocular 3 ml de medio LB líquido
(BD Ref. 244620) sin antibiótico y se incubó a 37 °C
durante toda la noche a 100 rpm. Se transfirieron 500
ìl de cada precultivo a matraces con 50 ml de medio
LB sin antibiótico y se incubaron con agitación (100
rpm) por 2-3 horas hasta alcanzar una OD600 (densidad
óptica) de 4.5 - 5.5. Se centrifugaron a 4000 rpm y
4 °C por 15 min y se descartó el sobrenadante. Se
disolvió la biomasa bacteriana en 20 ml de disolución
con MgCl /CaCl (80 mM y 50 mM respectivamente)
min, después, en baño maría a 42 °C por 1 min, y
nuevamente en hielo por 2 min. Se añadieron 250 l
de medio SOC (Super Optimal broth with Catabolite
repression), en zona estéril, y se incubó con agitación
(100 rpm, 37 °C) por una hora. Se sembraron 100 l
en medio agar LB selectivo. Las cuatro cepas
transformadas con pExp-Lib fueron plaqueadas en
medio selectivo con ampicilina [50 g/ml] (Sigma,
#Cat. A9528) y las cepas con pSF-CMV-Ub-puro-SV40
Ori Sbfl en medio selectivo con kanamicina [40 g/
ml] (Sigma, #Cat. K1876). Se incubaron a 37 °C por
toda la noche.
Método estadístico. Se calculó la eficiencia de
transformación para cada cultivo, y las eficiencias de
cada cepa con cada plásmido se compararon con
respecto a la eficiencia de DH5, con la prueba de
comparación múltiple de Bonferroni, este método
estadístico se engloba bajo la denominación de
contrastes para comparaciones múltiples, ya que su
objetivo fundamental es comparar entre sí medias de
tratamientos o grupos de ellas, y permite superar las
dificultades que surgen al aumentar el número de
grupos a comparar. En donde los parámetros de
comparación se expresan en términos del p value =<
0.0001 (***) significativo; (**) = medianamente
significativo; ns = no significativo. El orden y análisis
de los datos se llevó a cabo con los programas
Microsoft Excel y Graph Pad Prism v5.0.
Resultados
2 2
previamente enfriada, y se incubó por 90 min en hielo.
Se centrifugó nuevamente bajo las mismas condi-
ciones (a 4000 rpm y 4 °C por 15 min) y se descartó
el sobrenadante. Se resuspendieron los pellets en 2 ml
de la disolución MgCl2/CaCl2 (80 mM y 50 mM
respectivamente) fría, se adicionaron 2 ml de glicerol,
se homogenizaron las células y se prepararon alícuo-
tas de 100 l. Finalmente, se almacenaron a - 80 °C.
Una vez que se tuvieron las células quimio-
competentes de todas las cepas, se sometieron a un
proceso de transformación con dos diferentes
vectores cada una, pExp-Lib (Clontech, #Cat. 635003)
y pSF-CMV-Ub-puro-SV40 Ori Sbfl (Oxford Genetics,
Código OG136).
Transformación. Se añadieron 1.2613x1011
copias de cada vector a 100 l de cada cepa de
quimiocompetentes y se colocaron en hielo por 30
Se evaluó la compatibilidad de los plásmidos pSF-
CMV-Ub-puro-SV40 (pSF) y pExp-Lib (pExp) con dos
cepas multicopia (DH5 y XL1-blue), y dos cepas de
interés biotecnológico utilizadas para la expresión de
proteínas (BL21 y TG1). Las cepas utilizadas se
adecuaron para hacerlas competentes con un
protocolo modificado con MgCl2 y CaCl2 a concen-
traciones de 80 mM y 50 mM, respectivamente, con
el racional de aumentar la capacidad de las bacterias
para internalizar ADN exógeno. El protocolo de
transformación empleado se describe en materiales y
métodos, las bacterias se incubaron a 37 °C durante
toda la noche, para después hacer el conteo de colonias
y determinar el proceso de transformación más
efectivo. Los cultivos con las combinaciones bacteria-
plásmido más efectivos, es decir, los que presentaron
mayor número de colonias por placa fueron aquellos
SAMANTHA T. GARCÍA-CÁRDENAS, DANIELA G. RUVALCABA-HIDROGO, CARMEN C. ALVARADO-GONZÁLEZ, MARÍA G. GÓMEZ-FIERRO, ÓSCAR E. JUÁREZ-
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• Vol. XIII, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2019 •
donde se utilizó la cepa XL1-Blue, sin importar el
plásmido con que fue transformada (Figura 1A-E). Se
observó que las colonias obtenidas en la cepa BL21
mostraron mayor tamaño (Figura 1B-F), en
comparación con las colonias de las cepas XL1-Blue
(Figura 1A-E) y DH5 (Figura 1D-H). En este trabajo,
la eficiencia de transformación se representa en
unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/
ml). Las cepas transformadas con el plásmido pSF no
mostraron diferencias significativas entre ellas, sin
embargo, las bacterias DH5 mostraron diferencia
significativa de transformación con respecto a las
cepas XL1-Blue, y medianamente significativa con
BL21 y TG1, como se muestra en la Figura 2A. Al
calcular la eficiencia de transformación en las cepas
tratadas con el plásmido pExp, se observó que la
variabilidad entre estas fue muy marcada. Se encontró
una diferencia significativa entre las cepas DH5 y
XL1-Blue, medianamente significativa entre DH5 y
TG1 (Figura 2B). En contraste, las cepas DH5 y BL21
no mostraron una diferencia significativa en su
eficiencia de transformación (Figura 2B). En el caso
del plásmido pExp, la cepa que mostró mayor
eficiencia de transformación fue con la XL1-Blue,
medianamente con las bacterias TG1 y la cepa con
menor eficiencia DH5 (Figura 2B).
Figura 1. Evaluación de la eficiencia de transformación con los vectores de expresión pSF-CMV-Ub-puro-SV40 Ori Sbfl (Kanr) y pExp-Lib (Ampr) en
cuatro cepas de E. coli: XL1-Blue (A, E), BL21 (B, F), TG1 (C, G) y DH5 (D, H).
Figura 2. Eficiencia de transformación de diferentes cepas de E. coli y su comparación con DH5. A) Eficiencia de transformación con pSF-CMV-Ub-puro-
SV40 Ori Sbfl en diferentes cepas de E. coli. Comparación múltiple de Bonferroni. P value = 0.0003. B) Eficiencia de transformación con pExp-Lib en
diferentes cepas de E. coli. Comparación múltiple de Bonferroni. P value = <0.0001. *** = significativo, ** = medianamente significativo, ns = no significativo.
SAMANTHA T. GARCÍA-CÁRDENAS, DANIELA G. RUVALCABA-HIDROGO, CARMEN C. ALVARADO-GONZÁLEZ, MARÍA G. GÓMEZ-FIERRO, ÓSCAR E. JUÁREZ-
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• Vol. XIII, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2019 •
En la Figura 3 se muestra un resumen de los
resultados obtenidos al comparar la eficiencia de
transformación entre las distintas cepas bacterianas.
Se observó que el proceso de transformación más
eficiente fue en los tratamientos donde las bacterias
XL1-Blue y TG1 se transformaron con el plásmido
pExp. La eficiencia de transformación en las cepas
BL21 y DH5a no muestra diferencias notables al ser
transformadas con ambos plásmidos. Los resultados
obtenidos con el plásmido pExp muestran que la
eficiencia de transformación incrementa tres veces
el número de unidades formadoras de colonias al
combinar la cepa XL1-Blue, y se duplica en la cepa
TG1 en comparación con vector pSF. Los resultados
en términos de la compatibilidad que presentan los
plásmidos pExp y pSF con las cepas de E. coli en donde
fueron evaluadas, sugieren que la cepa XL1-Blue y el
vector pExp son los que presentan el mejor
rendimiento de transformación.
Figura 3. Análisis de eficiencia de transformación (en UFC/ml)
de cepas de E. coli, comparando los dos vectores de expresión
utilizados (pSF-CMV-Ub-puro-SV40 Ori Sbfl y pExp-Lib) con
cada cepa bacteriana.
Discusión
La clonación de productos de PCR en plásmidos
es una práctica común y necesaria en pasos
subsecuentes para llevar a cabo experimentos que
involucran ingeniería genética. La eficiencia de
transformacion es muy importante, puede afectar
directamente el éxito de todos los ensayos posteriores
y puede verse alterada por factores como la calidad
de las células competentes; por lo tanto, el estableci-
miento de un método químico de transformación
eficiente y rápido es deseable en cualquier laboratorio
de investigación que requiera de la biología molecular.
Los protocolos para preparar las células competentes
son diversos, y en aquellos donde se emplea el choque
térmico para hacer la transformación, las bacterias
son tratadas con CaCl2 a una concentración que oscila
entre 30-100 mM (Mandel y Higa, 1970; Chan et al.,
2013; Serrano-Rivero, 2013; Liu et al., 2018), el papel
del Ca2 es destruir la matriz de lípidos en la membrana
celular para formar un complejo con poli-hidroxi-
butrato y poli-fosfato inorgánico en la membrana
celular, para facilitar la infiltración de ADN exógeno
(Cohen et al., 1992; Pope y Kent, 1996). Existen casos
en que la preparación de las células competentes con
CaCl2 no es lo suficientemente efectivo, y tienen que
modificarse los protocolos agregando MgCl2 o MnCl2
con la finalidad de hacer más eficiente la trans-
formación de las bacterias (Chan et al., 2013; Liu et
al., 2018). Se ha reportado que la baja eficiencia de
transformación puede ser causada por la propiedad
antibacteriana de LFcin-B (Brogden, 2005) y puede
ser incrementada al agregar una concentración
moderada/alta de MnCl2 (50 mM) y CaCl2 (30 mM),
debido a que las propiedades antibacterianas de LFcin-
B pueden ser inhibidas por concentraciones de Ca2 y
Mn2 sin perder la permeabilidad de la membrana
celular (da Silva et al., 2012).
En este trabajo se evaluaron cuatro cepas de E.
coli con diferentes características y aplicaciones.
Fueron modificadas para hacerlas competentes y
aumentar su capacidad de internalizar DNA exógeno,
con un protocolo que incluye MgCl2 y CaCl2 a
concentraciones de 80 mM y 50 mM, respectivamente.
Los resultados obtenidos fueron expresados en
términos del número de colonias para determinar el
proceso de transformación más efectivo. Se formuló
una matriz de variantes experimentales donde a dos
plásmidos (pExp y pSF) se les determinó su
compatibilidad con las cepas seleccionadas. Al valorar
las eficiencias de transformación entre los plásmidos
seleccionados, los resultados obtenidos con pExp
sugieren que existe una mayor compatibilidad con
las cepas bacterianas XL1-Blue y TG1, no así, con las
cepas BL21 y DH5a (Figura 3).
SAMANTHA T. GARCÍA-CÁRDENAS, DANIELA G. RUVALCABA-HIDROGO, CARMEN C. ALVARADO-GONZÁLEZ, MARÍA G. GÓMEZ-FIERRO, ÓSCAR E. JUÁREZ-
ACOSTA, MAYELA R. ESPINOZA-DUARTE, GERARDO P. ESPINO-SOLÍS: Comparación de la eficiencia de transformación entre diferentes cepas de E. coli
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• Vol. XIII, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2019 •
No existe un consenso sobre la metodología más
adecuada para obtener una mejor eficiencia de
transformación. Dentro de los métodos de trans-
formación químicos, existen diferentes variables que
influyen en el proceso, como la cepa y plásmido
utilizados (y la cantidad de ambos), el método para
hacer competentes las células, con particular énfasis
en las soluciones utilizadas, el medio de recuperación
utilizado, y el gen de resistencia en cada plásmido. No
existe un estándar para determinar la eficiencia de
transformación, ya sea en función de la cantidad de
ADN o en UFC (Unidades Formadoras de Colonia).
Conclusiones
En el presente estudio, fue modificado un método
químico clásico para la obtención de células compe-
tentes; las bacterias fueron preparadas con una
solución MgCl2 (80 mM) y CaCl2 (50 mM) con la
finalidad de hacerlas más eficientes en la
internalización de los plásmidos seleccionados. Por la
importancia y aplicaciones en el área biotecnológica,
los plásmidos pSF-CMV-Ub-puro-SV40 (pSF) y pExp-
Lib (pExp) fueron evaluados en cepas de E. coli con
características y aplicaciones especializadas en
diversas técnicas de biología molecular. Dos de estas
cepas son reconocidas por ser buenas productoras-
duplicadoras de ADN (DH5 y XL1-blue), y las otras
dos son utilizadas para la expresión de proteína
recombinante (BL21 y TG1). En conclusión, al
comparar la eficiencia de transformación entre las
distintas cepas bacterianas y su afinidad por los
plásmidos empleados, pExp mostró el mejor
desempeño al ser ensayado en las las bacterias XL1-
Blue y TG1. Para el caso de las cepas BL21 y DH5a, y
el plásmido pSF, tendrán que diseñarse y ser
optimizados nuevos protocolos para aumentar la
eficiencia de transformación. Cabe resaltar que que la
eficiencia de transformación por métodos químicos
es mucho menor que la de la electroporación, sin
embargo, requiere de menor infraestructura y es más
económica. Algunos investigadores la consideran
inadecuada para experimentos de clonación
molecular, como la construcción de bibliotecas de
ADNc de alta complejidad, donde se cuenta con una
cantidad mínima de ARNm. De ahí la importancia de
contar con un protocolo en el laboratorio de un
método químico de transformación eficiente y rápido.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte con el
proyecto CONACYT: Apoyos Complementarios para
la Consolidación de Laboratorios Nacionales,
Laboratorio Nacional de Citometría de Flujo No.
293569.
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Este artículo es citado así:
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Duarte, G. P. Espino-Solís. 2019. Comparación de la eficiencia de transformación entre diferentes cepas de E. coli. TECNOCIENCIA
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• Vol. XIII, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2019 •
Resumen curricular del autor y coautores (cont.)
CARMEN CAROLINA ALVARADO GONZÁLEZ. Estudiante de la carrera de Ingeniería Biomédica en la Universidad Autónoma de Chihuahua.
Realizó su servicio social en el Laboratorio de Investigación Traslacional, ahora también Laboratorio Nacional de Citometría sede
Chihuahua. Actualmente realiza su tesis de licenciatura acerca de alacranes endémicos del estado de Chihuahua, llevando a cabo su
clasificación morfológica y caracterización bioquímica del veneno. Ha participado en cursos impartidos en su facultad, asistió al "2°
Curso de Animales Venenosos en México" en el Instituto de Biotecnología de la UNAM. Participó como ponente en el Simposio de
Investigación en Biomédica de la Facultad de Medicina y Ciencias Biomédicas de la UACH.
MARÍA GEORGINA GÓMEZ FIERRO. Es egresada de la carrera de Ingeniería Biomédica de la Facultad de Medicina y Ciencias Biomédicas
de la Universidad Autónoma de Chihuahua, con el mejor promedio de su generación. Ha sido becada por la Academia Mexicana de
Ciencias para realizar estancias de investigación en el Instituto de Biotecnología de la UNAM y en el Centro de Investigación y
Estudios Avanzados, sede Zacatenco. Ha participado como organizadora en talleres y cursos de inmunología y citometría de flujo.
Realizó su servicio social en el Laboratorio Nacional de Citometría de Flujo sede Chihuahua y actualmente trabaja en su tesis de
licenciatura en el mismo, en colaboración con el Instituto de Biotecnología de la UNAM.
OSCAR ENRIQUE JUÁREZ ACOSTA. Terminó su licenciatura en Ingeniería Biomédica en el 2018, por la Facultad de Medicina y Ciencias
Biomédicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua (UACH). Actualmente se encuentra realizando su tesis sobre la clasificación
morfológica y caracterización bioquímica del veneno de alacranes endémicos del estado de Chihuahua en el Laboratorio de
Investigación Traslacional, ahora Laboratorio Nacional de Citometría sede Chihuahua. En 2016 realizó su servicio social como
Ingeniero Biomédico en el Hospital Central Universitario del Estado de Chihuahua.
MAYELA ROSARIO ESPINOZA DUARTE. Es egresada de la segunda generación de Ingeniería Biomédica por la Universidad Autónoma de
Chihuahua, obtuvo una beca completa para participar en la primera escuela de verano en biotecnología "Una ventana al IBt y a
la investigación" por el Instituto de Biotecnología de la UNAM, realizó una estancia académica en el Laboratorio Nacional de
Citometría de Flujo de la UNAM. Ha presentado proyectos de investigación en cursos y congresos organizados por la IUIS-ALAI y
la Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería. Ha participado como organizadora y asistente a diversos cursos como la XIII
Escuela de proteínas, Actualización en Inmunología y Citometría de flujo. Actualmente es coordinadora de la sede en Chihuahua del
Laboratorio Nacional de Citometría de Flujo. Trabaja en líneas de investigación enfocadas a la citometría dentro del Laboratorio de
Investigación Traslacional.
GERARDO PÁVEL ESPINO-SOLÍS. Es Ingeniero Bioquímico por el Institituto Tecnológico de Durango; en el Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional Autónoma de México (IBT-UNAM) obtuvo los grados de Maestro y Doctor en Ciencias Bioquímicas, realizó
estudios postdoctorales en Baylor Institute for Immunology Research (BIIR), en Dallas Tx. Es Profesor - Investigador de Tiempo
Completo, titular C, en la Facultad de Medicina y Ciencias Biomédicas de la UACH. Ha publicado artículos de investigación original, en
revistas de circulación internacional, así como algunos trabajos de divulgación científica y dos patentes. Ha sido profesor y tutor en
los programas de maestría y doctorado en la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Autónoma de México, Universidad
Autónoma del Estado de Morelos (UAEM) y en Baylor University. Es miembro de la Sociedad Mexicana de Inmunología y Sociedad
de Glicobiología en Estados Unidos. Entre las disticiones que ha recibido destaca el reconocimiento como miembro del Sistema
Nacional de Investigadores Nivel 1 y perfil PRODEP. Actualmente dirige el Laboratorio de Investigación Traslacional y es Director
de la Sede en Chihuahua del Laboratorio Nacional de Citometría de Flujo.