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TECNOCIENCIA CHIHUAHUA, Vol. XVIII (1) e 1374 (2024)
https://vocero.uach.mx/index.php/tecnociencia
ISSN-e: 2683-3360
Artículo Científico
Extracción de ADN total de formas silvestres de
Phaseolus vulgaris L., con el método CTAB
Extraction of total DNA from wild forms of Phaseolus vulgaris L., with
the CTAB method
*Correspondencia: lwallanderc@ipn.mx (Liliana Wallander Compeán)
DOI:
Recibido:: 05 de octubre de 2023; Aceptado: 21 de febrero de 2024
Publicado por la Universidad Autónoma de Chihuahua, a través de la Dirección de Investigación y Posgrado
Editor de Sección: Dr. Guillermo Fuentes-Dávila
Resumen
Uno de los principales objetivos de la extracción de ADN es obtener material con alta pureza y en
cantidad suficiente. Se han reportado métodos para aislar ADN total a partir de tejido foliar de
Phaseolus vulgaris. Sin embargo, la alta variabilidad genética, la cual se manifiesta en diferentes
capacidades de acumulación de carbohidratos y compuestos fenólicos, dificulta los procesos de
extracción de ADN. En el presente estudio se evaluó la eficiencia de extracción de ADN foliar de dos
métodos basados en el uso de CTAB. Se usaron dos métodos: método 1, el cual incluyó el uso de
Proteinasa K y RNAsa y el método 2, sin las enzimas. El método 1, permitió obtener entre 115.55 y
1138.23 ng/μL de ADN, en cambio el método 2, permitió obtener mayor cantidad de ADN, entre
354.90 y 2513.10 ng/μL. La amplificación por PCR de marcadores ISTR generó bandas mejor resueltas
en las muestras de ADN obtenidas con el método 2 que con el método 1. El método 2 es efectivo y
económico para obtener ADN en cantidad y calidad adecuadas de genotipos silvestres de P. vulgaris,
que puede ser usado en estudios moleculares.
Palabras clave: proteinasa K, frijol común silvestre, enzimas, ADN, pureza.
Abstract
One of the main objectives of DNA extraction is to obtain material with high purity and in sufficient
Liliana Wallander Compeán*1,2, Norma Almaraz Abarca1, José Antonio Ávila Reyes1, Erika
Berenice León Espinosa2
1 Instituto Politécnico Nacional CIIDIR Unidad Durango, Av. Sigma 119, Fraccionamiento 20 de noviembre II,
Durango, Durango. C.P.34220.
2 Tecnológico de Estudios Superiores de San Felipe del Progreso, Av. Instituto Tecnológico s/n Ejido de San
Felipe, Edo. De México. C.P. 50640
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quantity. Methods to isolate total DNA from leaf tissue of Phaseolus vulgaris have been reported.
However, the high genetic variability, which manifests itself in different carbohydrate and phenolic
compound accumulation capacities, makes DNA extraction processes difficult. In the present study,
the leaf DNA extraction efficiency of two methods based on the use of CTAB was evaluated. Two
methods were used: method 1, which included the use of Proteinase K and RNAsa, and method 2,
without the enzymes. Method 1 yielded between 115.55 and 1138.23 ng/μL of DNA, whereas method
2 yielded more DNA, between 354.90 and 2513.10 ng/μL. PCR amplification of ISTR markers
generated better resolved bands in the DNA samples obtained with method 2 than with method 1.
Method 2 is effective and economical for obtaining DNA in adequate quantity and quality from wild
genotypes of P. vulgaris, which can be used in molecular studies.
Keywords: proteinase K, wild common bean, enzymes, DNA, purity.
1. Introducción
El género Phaseolus es originario del Continente Americano, comprende alrededor de 70
especies (Saburido y Herrera, 2015; Freytag y Debouck, 2002), de las cuales 50 se encuentran en
México (Pech, 2020). Actualmente cinco especies han sido domesticadas y se cultivan en mayor o
menor grado en todo el mundo, estas son Phaseolus vulgaris L., P. lunatus L., P. coccineus L., P.
acutifolius A. Gray, y P. polyanthus Greenman (Mateo, 2016). La especie más importante del género,
en términos económicos, alimenticios, agronómicos, y sociales es el frijol común (Phaseolus vulgaris)
(CEDRSSA, 2019). En este sentido, en México, el frijol común se encuentra distribuido desde el norte
del estado de Chihuahua hasta el sur del estado de Chiapas, a lo largo de la sierra madre Occidental
y en el Eje Neovolcánico del centro de México (Saburido y Herrera, 2015; Freytag y Debouck, 2002).
En el centro-norte de México, en el estado de Durango, crecen poblaciones silvestres de P. vulgaris
en condiciones semiáridas, de menos de 35 mm de precipitación anual y altitudes de 2200 m
(Wallander et al., 2022). Estas condiciones contrastan con las que predominan en el sur del estado de
Chiapas, donde la precipitación anual alcanza hasta 2000 mm a altitudes de 800 msnm, en donde
también se encuentran poblaciones silvestres de frijol común (Freytag y Debouck, 2002; Debouck,
2020). Esta capacidad de crecer bajo condiciones ambientales tan variables sugiere que P. vulgaris
tiene una capacidad biológica sobresaliente sustentada en una importante variabilidad genética
(Ríos et al., 2014; Curay, 2019). No obstante, para este tipo de estudios (variabilidad genética) el
aislamiento de ADN se debe realizar mediante un protocolo que permita obtenerlo en cantidades
suficientes y con alta pureza. Diversos laboratorios han estandarizado sus propios métodos de
extracción según la especie a estudiar, así mismo, algunos otros emplean kits comerciales que
garantizan el aislamiento de ADN a partir de una amplia gama de especies. Sin embargo, el costo es
elevado y no siempre se obtiene la cantidad y la calidad adecuadas. Los diferentes métodos que
existen para aislar ADN total de especies vegetales, utilizan el cloroformo y el etanol como solventes
orgánicos y después se purifica el ADN presentando la desventaja de ser complicados y su
realización requiere periodos largos de tiempo (Reyes, 2014).
Actualmente, se usa el detergente catiónico bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) como
componente de los reguladores de extracción de ADN en sustitución del detergente dodecilsulfato
de sodio (SDS) por medio del cual Shagai et al. (1984) amplificaron y redujeron el tiempo empleado
para aislar ADN de especies vegetales. El CTAB precipita los ácidos nucleicos en presencia de
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concentraciones bajas de cloruro de sodio, reduciendo la precipitación de polisacáridos y proteínas
contaminantes (Shagai et al., 1984; Reyes et al., 2011).
Se han reportado métodos para aislar ADN total a partir de tejido foliar de P. vulgaris de algunas
variedades (Miranda et al., 2006; Castellanos et al., 2017) y formas silvestres (Lépiz et al., 2010;
Wallander et al., 2022). Sin embargo, dada la alta variabilidad genética reportada para esta especie
(Castellanos et al., 2017), que se puede manifestar en diferentes capacidades de acumulación de
carbohidratos y compuestos fenólicos en los tejidos, los cuales dificultan los procesos de extracción
de ADN (Rojas et al., 2014; Aboul y Oraby, 2019), es importante evaluar la eficiencia de esos métodos
para diferentes genotipos de P. vulgaris. El objetivo del presente estudio fue evaluar la eficiencia de
extracción de ADN foliar de dos métodos basados en el uso de CTAB, en 10 formas silvestres de P.
vulgaris.
2. Materiales y métodos
2.1 Materiales
Las semillas de diez formas silvestres del estado de Durango, México, se recolectaron de siete
municipios en el año 2017. Diez semillas de cada forma silvestre obtenidas de diferentes municipios
del estado de Durango (Fig. 1) se germinaron, posteriormente se recolectó de manera individual el
material foliar de las plántulas de entre 20 y 35 días posteriores a la germinación para extraer el ADN
por el método de CTAB descrito por Coelho et al. (2009).
Figura 1. Mapa de los municipios donde se colectaron las semillas de las formas silvestres de Phaseolus vulgaris
de Durango, México, analizadas en el presente estudio.
Figure 1. Map of the municipalities where the seeds of the wild forms of Phaseolus vulgaris from Durango,
Mexico, were analyzed in the present study.
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2.2 Métodos
2.2 Extracción de ADN
La extracción del material genético se realizó de acuerdo a la metodología reportada por
Coelho et al. (2009).
2.2.1 Método 1: agregando Proteinasa K y RNAsa
El ADN total se extrajo a partir de 100 mg de tejido foliar. Se prescindió del primer paso del
protocolo de Coelho et al. (2009), que era la pulverización del tejido foliar con nitrógeno líquido. Los
tejidos se homogeneizaron en 800 μL de regulador de extracción [CTAB al 2 %, NaCl 1.4 M, Tris-HCl
10 mM, pH 8.0, EDTA 20 mM, 2-mercaptoetanol al 2 %, y polyvinylpyrrolidone (PVP peso molecular
40 000) al 3 %]. Después, se agregaron 2 μL de Proteinasa K, y las muestras se incubaron a 37 °C por
30 min. Posteriormente, las muestras se incubaron a 65 °C durante 60 minutos. Después, las muestras
se combinaron con 600 μL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se agitaron y se centrifugaron (10
000 rpm durante 10 min, a temperatura ambiente). El sobrenadante, fase acuosa conteniendo el ADN
disuelto, se recuperó y se volvió a fraccionar con cloroformo: alcohol isoamílico. La fase acuosa
resultante se recuperó y combinó con 500 μL de isopropanol frío y se incubó durante 30 min a -20 °C
para precipitar el ADN. Se centrifugó (10 000 rpm durante 10 min), se descartó el sobrenadante, la
pastilla conteniendo el ADN se resuspendió en 300 μL de TE (Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA-Na 1.0
mM), y se agregaron 150 μL de NaCl 5.0 M. Después, se adicionaron 900 μL de etanol absoluto frío.
Después de incubar a -20 °C durante 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 10 000 rpm durante
10 minutos. Se descartó el sobrenadante y la pastilla se lavó con 500 μL de etanol al 75 %. Se repitió
el último paso de lavado con etanol al 75 %. Estos dos lavados con etanol fueron adicionales al
protocolo original de Coelho et al. (2009). Después de centrifugar (10 000 rpm durante 10 min), el
sobrenadante se descartó, la pastilla de ADN se dejó secar a temperatura ambiente, y se resuspendió
en 50 μL de TE y 2 μL de RNAsa.
2.2.2 Método 2: sin agregar Proteinasa K y RNAsa
En este protocolo se eliminó del método original de Coelho et al. (2009) el paso de agregar los
2 μL de Proteinasa K después de agregar el buffer de extracción. Además, se eliminó el último paso
donde se agrega la RNAsa, al final, después de centrifugar en el último lavado, el sobrenadante se
descartó, la pastilla de ADN se dejó secar a temperatura ambiente, y se resuspendió en 50 μL de TE.
Los efectos de la Proteinasa K ayuda a digerir proteínas y eliminar contaminantes que pueden
degradar el ADN y el ARN durante la purificación, y la enzima RNAsa permite que el ADN extraído
quede limpio de ARN, lo que hace es catalizar la degradación del RNA en componentes más
pequeños (Fernández, 2023).
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2.2.3 Cuantificación, pureza y evaluación del tamaño molecular y de la integridad
del ADN obtenido
La cuantificación de ADN obtenido se realizó de manera espectrofotométrica. Se tomaron 2 μL
de cada solución individual de ADN. Se registraron los valores de absorbancia a 260 y 280 nm, con
los cuales se estimó la cantidad de ADN presente en cada muestra (Chan et al., 1992). La pureza del
ADN obtenido para cada muestra se evaluó con métodos espectrométricos de acuerdo a Sambrook
et al. (2001). Se registraron los valores de absorbancia a 260 y 280 nm y se calcularon los valores de la
relación A260/A280. Valores de esas proporciones iguales o mayores de 1.7 indicaron que el ADN se
encontraba lo suficientemente libre de proteínas para poder ser amplificado por PCR. La evaluación
del tamaño molecular y de la integridad de las muestras de ADN se realizó por electroforesis en
geles de agarosa (0.8 %), de acuerdo con Andrews (1994). La electroforesis se desarrolló a 70 volts.
Los geles se tiñeron con Syber Green.
2.2.4 Amplificación del ADN obtenido por PCR
Para determinar que las muestras de ADN obtenido podían ser amplificadas, se utilizó un par
de iniciadores de marcadores ISTR (Inverse Sequence Tagged Repeat, por sus siglas en inglés, en
español “Secuencias Inversas, Etiquetadas y Repetidas) (De Jesús et al., 2011). La amplificación de
loci ISTR se realizó de acuerdo con el método de Osorio et al. (2006), con los iniciadores F9
(TTACCTCCTCCATCTCGT) y B8 (ATACCTTTCAGGGGGATG). Para cada muestra individual se
preparó una mezcla de reacción conteniendo los iniciadores F9 y B8 a 10 mM, 3 μL de regulador de
la enzima Taq polimerasa, 1.2 μL de una solución de MgCl2 50 mM, 0.5 μL de la mezcla de
nucleótidos 10 mM, 0.3 μL de Taq polimerasa 1U, ADN molde a 25 nM, y agua para ajustar el
volumen de reacción a 20 μL. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: un primer ciclo
de desnaturalización a 95 °C durante 3 min; 40 ciclos, comprendiendo un paso de desnaturalización
a 95 °C durante 30 segundos, uno de alineación a 45 °C durante 1 min, y uno de extensión a 72 °C
durante 2 min; finalizando con 10 min a 72 °C. Las bandas amplificadas se visualizaron en un gel de
poliacrilamida al 5 %.
2.3 Diseño experimental y análisis de datos
Los datos se sometieron a análisis de varianza y prueba de discriminación de medias de Tukey
(P < 0.05), se calcularon coeficientes de variación (Gutiérrez 1996), para determinar la contribución
de la diferenciación entre poblaciones silvestres de frijol común a la concentración y pureza del ADN,
se sometieron a la prueba de análisis de componentes principales (PCA) utilizando el programa
XLSTAT versión 2021 2.2 (Addison, 2024).
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3. Resultados y discusión
3.1 Extracción de ADN
Los valores de A260, A280 y A260/280 aislado de cada una de las 10 formas silvestres de frijol común
con cada uno de los dos métodos evaluados se muestran en la Tabla 1. Se ha reportado que valores
de la relación A260/A280 mayores o iguales a 1.7 representan muestras de ADN con pureza adecuada
(Reyes et al., 2011; Guzmán et al., 2018), las cuales se pueden utilizar en la mayoría de las técnicas
moleculares. De acuerdo con los resultados obtenidos (Tabla 1), el 40 % de las muestras de ADN
extraídas con el método 1 cumplió con esa consideración de pureza, mientras que el 100 % de las
muestras obtenidas con el método 2 alcanzaron el valor de pureza señalado. Sin embargo, todas las
muestras obtenidas con los dos métodos evaluados pudieron ser amplificadas con los iniciadores de
ISTR usados, como se mostrará más adelante. Los resultados del presente estudio sugieren que los
requerimientos de pureza de muestras de ADN podrían en realidad ser más amplios. Los valores de
pureza de los ADN de las 10 formas silvestres, obtenidos con el método 2 fueron más altos que el
valor de pureza reportado por Reyes et al. (2011) para P. vulgaris cultivado (A260/A280 = 1.65).
Tabla 1. Valores promedios (n=10 desviación estándar?) de A260, A280, A260/280 de 10 formas silvestres de
Phaseolus vulgaris, obtenido con dos métodos de extracción modificados del de Coelho et al. (2009).
Table 1. Average values of A260, A280, A260/280 of 10 wild forms of Phaseolus vulgaris, obtained with two
extraction methods modified from that of Coelho et al. (2009).
Abs260
Abs280
Abs260/280
Método 1
0.73 ± 0.14 bcde
0.37 ± 0.07 bcd
1.98 ± 0.03 ab
0.82 ± 0.50 bcde
0.44 ± 0.24 bcd
1.91 ± 0.09 ab
1.13 ± 0.63 bcd
0.58 ± 0.28 abc
1.85 ± 0.26 ab
0.81 ± 0.52 bcde
0.43 ± 0.24 bcd
1.78 ± 0.25 b
0.43 ± 0.37 cde
0.29 ±0.25 bcd
1.49 ± 0.02 c
0.40 ± 0.29 cde
0.28 ± 0.21 bcd
1.43 ± 0.06 c
0.53 ± 0.37 cde
0.36 ± 0.25 bcd
1.49 ± 0.07 c
0.18 ± 0.11 e
0.12 ± 0.07 cd
1.46 ± 0.12 c
0.11 ± 0.06 e
0.07 0.03 d
1.44 ± 0.19 c
0.19 ± 0.08 de
0.12 ± 0.05 cd
1.56 ± 0.09 c
Método 2
0.88 ± 0.28 bcde
0.46 ± 0.13 bcd
1.90 ± 0.13 ab
2.02 ± 0.36 a
0.99 ± 0.17 a
2.03 ± 0.02 a
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1.03 ± 0.26 bcd
0.55 ± 0.68 bc
1.86 ± 0.06 ab
1.56 ± 0.88 ab
0.77 ± 0.43 ab
2.02 ± 0.03 a
1.07 ± 0.31 bcd
0.54 ± 0.14 bc
1.97 ± 0.09 ab
0.77 ± 0.24bcde
0.39 ± 0.11 bcd
1.94 ± 0.09 ab
0.57 ± 0.24 cde
0.29 ± 0.12 bcd
1.91 ± 0.05 ab
0.29 ± 0.21 de
0.16 ± 0.11 cd
1.77 ± 0.16 b
1.04 ± 0.25 bcd
0.54 ± 0.14 bc
1.90 ± 0.08 ab
1.28 ± 0.60 abc
0.65 ± 0.30 ab
1.94 ± 0.02 ab
Media ± desviación estándar, n= 10, por cada forma silvestre. Diferentes letras indican diferencias
significativas entre las poblaciones P<0.05 (prueba de Tukey).
3.1.1 Cuantificación del ADN obtenido
En la Fig. 2 se presentan las diferencias significativas en la concentración de ADN obtenido
para cada una de las 10 formas silvestres de frijol común con los dos métodos evaluados. Se observa
que el método 2 permitió obtener entre 185.90 ng/μL para la forma silvestre de Pueblo Nuevo 2, y
2513.10 ng/μL para la forma de Súchil 1, mientras que el método 1 permitió obtener entre 130.10
ng/μL para la población San Dimas 1, y 1502.40 ng/μL para la forma Súchil 2. La cantidad obtenida
de ADN fue muy variable entre las formas silvestres, lo cual se puede deber a los diferentes
contenidos de compuestos fenólicos que cada una de ellas acumula, como fue corroborado por
(Wallander et al. 2022). Sin embargo, el método 2 permitió obtener mayores concentraciones de ADN
que el método 1 en el 70 % de las muestras.
Se ha reportado que las cantidades de ADN requeridas para llevar a cabo estudios moleculares
varían entre 20 y 50 ng/μL (Mellado, 2020). Como se observa en la Fig. 2, las cantidades obtenidas
con ambos métodos para las 10 formas silvestres fueron mayores que esos valores.
El protocolo de extracción 2 permitió obtener cantidades mayores de ADN que el método 1 (Fig. 2),
y esos ADN tuvieron una pureza también mayor que los obtenidos con el método 1 (Tabla 1). El
método de CTAB de Coelho et al. (2009) fue utilizado para obtener ADN de Phaseolus vulgaris
cultivado por Reyes et al. (2011); estos autores obtuvieron una cantidad de ADN superior a
cualquiera de las obtenidas en el presente trabajo (3996.249 ng/μL).
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Figura 2. Concentración de ADN obtenido de tejido foliar de 10 formas silvestres de frijol común (Phaseolus
vulgaris) de Durango, México. M1: método; agregando Proteinasa K y RNAsa. M2: método sin agregar enzimas.
Diferentes letras indican diferencias significativas entre las poblaciones P<0.05 (prueba de Tukey), las barras de
error son ± DS.
Figure 2. Concentration of DNA obtained from leaf tissue of 10 wild forms of common bean (Phaseolus
vulgaris) from Durango, Mexico. M1: method; adding Proteinase K and RNase. M2: method without adding
enzymes. Different letters indicate significant differences between populations P < 0.05 (Tukey’s test), error bars
are ± SD.
3.1.2 Coeficiente de variación
El coeficiente de variación más bajo en la eficiencia de extracción entre formas silvestres de
frijol común fue en el método 1 (Tabla 2); para concentración Súchil 2 (1.24 %) y San Dimas 2 (9.08
%), y para pureza Canatlán (0.48 %) y Súchil 2 (1.43 %), en el método 2; para concentración Súchil 1
(4.18 %), Súchil 2 (6.57 %) y San Dimas 1 (9.73 %) y Nuevo Ideal (4.85 %), y para pureza para San
Dimas 2 (0.82 %), Súchil 1 (1.07 %), Nombre de Dios (2.25 %), Pueblo Nuevo 1(2.23 %), Súchil 2 (4.04
%), Nuevo Ideal (4.25 %). De los métodos probados, recomendamos utilizar el método 2. Estos
resultados son ampliamente aplicables para estudios de laboratorio en ISTR. Las recomendaciones
también se pueden utilizar para informar la elección de la metodología para los estudios de campo.
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Tabla 2. Coeficiente de variación (CV, %) de la concentración y pureza del ADN
Table 2. Coefficient of variation (CV, %) of the concentration and purity of DNA
Forma silvestre
Concentración
(ng/μL)
Pureza
A260/A280
Método 1
El Mezquital
18.70
1.39
Súchil 1
34.36
3.88
Súchil 2
1.24
1.43
Nombre de Dios
63.35
3.38
Canatlán
14.29
0.48
Nuevo Ideal
21.71
6.09
Pueblo Nuevo 1
13.30
5.94
Pueblo Nuevo 2
10.88
2.74
San Dimas 1
38.58
4.31
San Dimas 2
9.08
7.11
Método 2
El Mezquital
14.02
8.87
Súchil 1
4.18
1.07
Súchil 2
6.57
4.04
Nombre de Dios
13.41
2.25
Canatlán
14.16
5.80
Nuevo Ideal
4.85
4.25
Pueblo Nuevo 1
23.51
2.23
Pueblo Nuevo 2
20.51
11.27
San Dimas 1
9.73
4.45
San Dimas 2
22.93
0.82
N= 10, Coeficiente de variación (Ángel, 1996)
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3.2 Evaluación del tamaño molecular y de la integridad del ADN obtenido
La integridad de ADN se visualizó en geles de agarosa al 0.8 %. Los resultados mostrados en
la Fig. 3 indican que una mayor degradación del ADN se produjo con el método 2, como lo indicó la
presencia de un fondo fluorescente a lo largo de los carriles, en las muestras de ADN obtenidas con
ese método. Los resultados de la Fig. 3 también indican que los dos protocolos de aislamiento
evaluados permitieron obtener ADN de alto peso molecular a partir de tejido foliar de frijol común
silvestre.
Figura 3. Integridad del ADN de cinco formas silvestres de Phaseolus vulgaris obtenido con los dos
métodos evaluados. M1: método 1, M2: método 2. (Descrito en materiales y métodos).
Figure 3. DNA integrity of five wild forms of Phaseolus vulgaris obtained with the two methods evaluated.
M1: method 1, M2: method 2. (Described in materials and methods)
3.3 Amplificación del ADN obtenido por PCR
En la Fig. 4 se muestran, los resultados de la separación electroforética en geles de acrilamida
al 6 % de la amplificación de marcadores ISTR, revelados por la combinación de iniciadores F9/B8,
de la forma silvestre de El Mezquital. Se observa que los ADN obtenidos con el método 2 generaron
perfiles de amplificación formados por un mayor número de bandas, las cuales estuvieron mejor
definidas que con el método 1. Las bandas representaron secuencias ISTR de alrededor de 1000 y
1500 pb. Estos resultados sugieren que valores de pureza de ADN menores de 1.7 pueden ser
amplificados con los iniciadores de marcadores ISTR.
El método 2, modificado del de Coelho et al. (2009), simplifica a este último en términos de uso de
reactivos y en pasos durante el desarrollo, por tanto, tiene un menor costo y tiempo. El método 2,
que prescinde de la adición de enzimas puede ser usado para estudios de variabilidad genética de
formas silvestres de frijol común, empleando marcadores ISTR.
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Figura 4. Amplificación de los iniciadores F9/B8 de marcadores ISTR del ADN obtenido con los dos métodos
evaluados, de nueve individuos de la forma silvestre de El Mezquital de Phaseolus vulgaris. A) Método 1. Carril
1: marcador de tamaño molecular de 25pb. Carriles 1 a 10: individuos de la población El Mezquital y B) Método
2. Carril 1: marcador de tamaño molecular 25pb. Carriles de 2 a 9: individuos de la población, de El Mezquital.
Figure 4. Amplification of the F9/B8 primers of ISTR markers from the DNA obtained with the two methods
evaluated, from nine individuals of the wild form of Phaseolus vulgaris from El Mezquital. A) Method 1. Lane 1:
25pb molecular size marker. Lanes 1 to 10: individuals from the population, from El Mezquital and B) Method
2. Lane 1: 25pb molecular size marker. Lanes 1 to 9: individuals from the population, from El Mezquital
3.4 Análisis de Componentes Principales
Se determinó la contribución del comportamiento del coeficiente de variación de la
concentración y pureza del ADN por medio de un análisis de PCA. Un componente principal,
asociado con la pureza del ADN en el método 2, explicó el 51.19 % de la varianza encontrada, el
Componente 2 explicó el 48.81 % y se observó que está asociado al coeficiente de variación de la
concentración obtenida por medio del método 1 (Fig. 5).
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Figura 5. Resultados del análisis de agrupamiento basados en los resultados del coeficiente de variación de
la concentración de ADN (ng/μL) y la pureza (A260/280) de formas silvestres de frijol común de Durango, México.
Figure 5. Results of clustering analysis based on the results of the coefficient of variation of DNA
concentration (ng/μL) and purity (A260/280) of wild forms of common bean from Durango, Mexico.
4. Conclusiones
Se concluye que las modificaciones que se hicieron al método de Coelho et al. (2009), minimiza
costos ya que se prescinde de agregar el nitrógeno líquido para la pulverización de la muestra,
además de no incluir las enzimas Proteinasa K y RNasa. La cantidad y pureza del ADN obtenido
con ambas modificaciones en el método fue variable entre las diez formas silvestres de frijol común
evaluados. Sin embargo, el método 2, el cual prescinde del uso de Proteinasa K y RNAsa permitió
obtener mayor cantidad y mejor pureza de ADN que el método 1 en todos los genotipos. A pesar de
que algunas muestras de ADN obtenidas con el método 1 no cumplieron con el valor estándar de
pureza, todas las muestras de ADN pudieron amplificarse con iniciadores de los marcadores
moleculares ISTR; sin embargo, las muestras obtenidas con el método 2 generaron un mayor número
de bandas y éstas se resolvieron mejor en los geles de acrilamida. Aunque fue variable entre
genotipos, el método 2 es más eficiente, rápido y económico que el método 1 para obtener ADN de
los genotipos de frijol común analizados e idóneo para estudios moleculares.
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Agradecimientos
Al Instituto Politécnico Nacional y al CONAHCYT por los apoyos para realizar el presente trabajo.
Conflicto de interés
Los autores declaran no hay conflicto de intereses, en la publicación de estos resultados.
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2024 TECNOCIENCIA CHIHUAHUA
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