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TECNOCIENCIA CHIHUAHUA, Vol. XVII (1) e 1099(2023)
https://vocero.uach.mx/index.php/tecnociencia
ISSN-e: 2683-3360
Artículo Científico
Geles covalentes de arabinoxilanos ferulados
inducidos con lacasa o peroxidasa: estructuras de
entrecruzamiento, características reológicas y
actividad antioxidante
Covalent gels of ferulated arabinoxylans induced with laccase or
peroxidase: cross-linking structures, rheological characteristics and
antioxidant activity
*Correspondencia: karlagm@ciad.mx (Karla G. Martínez-Robinson), ecarvajal@ciad.mx (Elizabeth Carvajal-Millan)
DOI: https://doi.org/10.54167/tch.v17i1.1099
Recibido:: 11 de noviembre de 2022; Aceptado: 14 de abril de 2023
Publicado por la Universidad Autónoma de Chihuahua, a través de la Dirección de Investigación y Posgrado
Resumen
Los arabinoxilanos ferulados (AX) forman geles covalentes por acoplamiento oxidativo del ácido
ferúlico (AF) generando dímeros (di-AF) y trímeros de AF como estructuras de entrecruzamiento.
En esta investigación se estudió el efecto de la gelificación de AX inducida con lacasa o peroxidasa,
sobre las estructuras de entrecruzamiento, las características reológicas y la actividad antioxidante
de los geles desarrollados. Los geles de AX al 2% (p/v) formados con peroxidasa registraron valores
mayores de di-AF (0.195 µg/g) y módulo elástico (94 Pa) respecto a los obtenidos con lacasa (0.153
µg/g y 79 Pa, respectivamente). Además, los geles inducidos con peroxidasa presentaron mayor
actividad antioxidante (13.21 y 3.3 µmol de TEAC/g muestra por método ABTS+ y DPPH,
respectivamente) en relación con los generados con lacasa (9.63 y 3.0 µmol de TEAC/g muestra por
Nedie S. Chávez-Gutiérrez1, Karla G. Martínez-Robinson1*, Rafael Canett-Romero3, María D.
Figueroa-Pizano1, Alma C. Campa-Mada1, Yubia B. De Anda-Flores1, Jorge A. Marquez-
Escalante1, Agustín Rascón-Chu2, Elizabeth Carvajal-Millan 1*
1 Biopolímeros, CTAOA. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. Carretera Gustavo
Enrique Astiazarán Rosas No. 46, Hermosillo, Sonora, México. CP 83304. Tel. (662) 289 2400.
2 Biotecnología, CTAOV. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. Carretera Gustavo
Enrique Astiazarán Rosas No. 46, Hermosillo, Sonora, México. CP 83304. Tel. (662) 289 2400.
3 Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos, División de Ciencias Biológicas y de la Salud,
Universidad de Sonora. Blvd. Luis Encinas y Av. Rosales. Hermosillo, Sonora, México. CP. 83000
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método ABTS+ y DPPH, respectivamente), lo cual podría atribuirse al mayor contenido de di-AF 8-
5’ y 5-5´. Es posible que las diferencias entre estos geles estén relacionadas con el mecanismo de
acción de las enzimas utilizadas. La lacasa oxida directamente al AF en AX mientras que, con
peroxidasa, el H2O2 realiza esta acción y, por su bajo peso molecular, podría acceder más fácilmente
al AF del polisacárido, favoreciendo su entrecruzamiento.
Palabras clave: Arabinoxilanos ferulados, lacasa, peroxidasa, geles, caracterización
Abstract
Ferulated arabinoxylans (AX) form covalent gels by oxidative coupling of ferulic acid (FA) generating
dimers (di-FA) and FA trimers as crosslinking structures. In this investigation, the effect of AX
gelation induced with laccase or peroxidase on the cross-linking structures, rheological
characteristics and antioxidant activity of the developed gels was studied. The 2% (w/v) AX gels
formed with peroxidase registered higher values of di-FA (0.195 µg/g) and elastic modulus (94 Pa)
compared to those obtained with laccase (0.153 µg/g and 79 Pa, respectively). In addition, the gels
induced with peroxidase presented higher antioxidant activity (13.21 and 3.3 µmol of TEAC/g sample
by the ABTS+ and DPPH method, respectively) in relation to those generated with laccase (9.63 and
3.0 µmol of TEAC/g sample by the ABTS+ method and DPPH, respectively), which could be
attributed to the higher content of di-FA 8-5' and 5-5'. It is possible that the differences between these
gels are related to the mechanism of action of the enzymes used. Laccase directly oxidizes FA in AX
while, with peroxidase, H2O2 performs this action and, due to its low molecular weight, could more
easily access the FA of the polysaccharide, favoring its crosslinking.
Keywords: Ferulated arabinoxylans, laccase, peroxidase, gels, characterization
1. Introducción
Los arabinoxilanos ferulados (AX) son polisacáridos presentes en diversos cereales, tanto en
pericarpio y aleurona como en endospermo. En los últimos años se ha acrecentado el interés por los
AX y sus derivados ya que se han asociado con efectos benéficos a la salud como antioxidantes
(Malunga y Beta, 2015), prebióticos (Marquez-Escalante et al., 2018), inmunoestimulantes (Mendis et
al., 2016), reguladores de glucosa y colesterol (Vogel et al., 2012) y agentes antiproliferativos (Melo-
Silveira et al., 2019).
Una característica importante de los AX es su capacidad para producir geles por entrecruzamiento
de sus cadenas poliméricas mediante acoplamiento oxidativo del ácido ferúlico (AF) por vía
enzimática. Las enzimas lacasa y peroxidasa inducen la formación de dímeros (di-AF) y trímeros (tri-
AF) de AF. Estos entrecruzamientos covalentes en la red polimérica proporcionan a los geles de AX
características particulares como ser poco afectados por cambios de temperatura, fuerza iónica o pH.
Debido a lo anterior, a estos geles se les atribuye un gran potencial de aplicación como matrices para
la liberación controlada de biomoléculas en la industria alimentaria, biomédica y biotecnológica
(Knudsen y Lærke, 2010; Mendez-Encinas et al., 2018).
Las características estructurales de los AX están relacionadas con su fuente y definen las propiedades
de los geles formados; por ejemplo, los AX de maíz presentan un mayor contenido de AF que los AX
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de trigo y por lo tanto forman geles con un contenido más alto de di-AF comparado con geles de AX
de trigo (Niño-Medina et al., 2010). En este sentido, una fuente importante para la obtención de los
AX es el residuo obtenido de la producción de bioetanol de maíz llamado granos secos de destilería
con solubles (Dried distillers grains with solubles, DDGS) (Fierro-Islas et al., 2018). Este subproducto
de maíz es de bajo costo y destinado principalmente a la alimentación de animales por lo que su uso
como fuente de AX representa una alternativa interesante para otorgarle valor agregado y aumentar
la sustentabilidad de la producción de bioetanol de maíz (Mendez-Encinas et al., 2018).
Respecto a la gelificación de los AX, se ha reportado que el tipo de agente entrecruzante utilizado
tiene un efecto en las propiedades de los geles formados (Martínez-López et al., 2019). Sin embargo,
no existe información suficiente que permita comparar el efecto de distintas enzimas en la gelificación
de AX con diferentes características. En este sentido es necesario generar nuevo conocimiento sobre
el efecto de la relación entre estructura de AX, enzima entrecruzante y características de los geles de
AX formados. Por otro lado, se ha encontrado que, en general, la actividad antioxidante de los AX
disminuye al formar un gel debido al acoplamiento oxidativo del AF que origina los di-AF y tri-AF,
lo cual implica una reducción en el contenido de AF en el gel (Mendez-Encinas et al., 2019a). No
obstante, no se conoce aún el efecto de la formación de geles de AX con distinta enzima entrecruzante
sobre la actividad antioxidante de estos materiales.
Por lo anteriormente expuesto, el objetivo del presente trabajo de investigación es estudiar el efecto
del tipo de agente entrecruzante (lacasa o peroxidasa) sobre las estructuras de entrecruzamiento, las
características reológicas y la actividad antioxidante de AX.
2. Materiales y métodos
2.1 Fuente de Obtención de los AX
Se utilizaron AX extraídos de un subproducto de la producción de bioetanol de maíz, los
granos secos de destilería con solubles (DDGS), de acuerdo con el método reportado por Mendez-
Encinas et al. (2019a). Los AX se extrajeron mediante hidrólisis alcalina con NaOH 0.5 N (25 °C, 2 h).
Los sólidos se eliminaron por filtración (20-25 μm) y el filtrado se centrifugó a 12,096 g a 20 °C por 15
min (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). El sobrenadante se acidificó a pH 4 con HCl 3N. El
líquido acidificado se centrifugó (12,096 g a 20 °C por 15 min), el sobrenadante se precipitó en etanol
al 65% (v/v) a 4 °C y se secó por intercambio de solventes (Mendez-Encinas et al., 2019a). La muestra
seca se definió como arabinoxilanos ferulados (AX). El rendimiento de los AX se calculó en porcentaje
(% peso seco AX/peso seco DDGS) de acuerdo con la fórmula:
%
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2.2 Caracterización de los AX
Identidad molecular
Se utilizó espectrometría infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) (Nicolet iS50 FTIR,
Nicolet Instrument Corp., Madison, WI, EUA) con reflectancia total atenuada (ATR), en modo de
absorbancia de 400-4000 cm-1 y 4 cm-1 de resolución, siguiendo el procedimiento reportado por De
Anda-Flores et al. (2020).
Contenido de azúcares neutros
El contenido de azúcares neutros se determinó mediante cromatografía líquida de alta
resolución (CLAR), de acuerdo con la metodología establecida por Carvajal-Millan et al. (2007). La
muestra de polisacárido se sometió a una hidrólisis con ácido trifluoroacético 4N a 120 ˚C durante 2
h, utilizando manitol como estándar interno. La reacción se detuvo con hielo y el extracto fue
evaporado a 50 ˚C y enjuagado dos veces con 200 µL de agua Milli-Q. El extracto evaporado fue
solubilizado en 1 mL de agua ultrapura y se filtró utilizando un tamaño de poro de 0.45 µm,
(Whatman, Maidstone, Reino Unido). Se utilizó un equipo de CLAR (Waters e2695 Separation
Module, Milford, EUA) con un detector de índice de refracción (Waters 2414, Milford, EUA). La
muestra se inyectó en una columna CH Pb (7.8 x 300 mm, Waters, Milford, MA, EUA) y se utilizó
una elución isocrática con agua a un flujo de 0.4 mL/min a 70 ˚C.
Contenido de AF, di-AF y tri-AF
La cuantificación de AF, di-AF y tri-AF en AX se realizó mediante cromatografía líquida de
alta resolución en fase reversa (CLAR-FR), de acuerdo con Vansteenkiste et al. (2004). A 100 mg de
AX se agregaron 10 mL de NaOH 2N y la mezcla se mantuvo en agitación a 100 rpm y 25 °C (KS 3000
ic control, IKA, NC, EUA) durante 2 h en atmósfera de nitrógeno y ausencia de luz. Posteriormente,
la mezcla se neutralizó con 1 mL de HCl 2N. Después se agregaron 5 mL de éter etílico, se centrifugó
a 1000 g, 20 ˚C y 5 min, y el sobrenadante se recuperó en ausencia de luz. Nuevamente, la muestra se
trató con 5 mL de éter etílico, se centrifugó y se recuperó siguiendo el procedimiento anteriormente
descrito. El sobrenadante recuperado fue evaporado a 35 ˚C bajo flujo de nitrógeno y el concentrado
se resuspendió en 1 mL de mezcla agua:metanol:ácido acético (60:30:10 v/v) y se filtró (0.45 µm,
Whatman, Maidstone, Reino Unido). Los extractos se inyectaron en una columna Altima C18 (250mm
x 4.6 mm, Alltech Associates, Inc., Deerfield, EUA) colocada en un equipo CLAR (Waters e2695
Separation Module, Milford, EUA) acoplado un detector de arreglo de diodos (Waters 2998, Milford,
EUA) a una longitud de onda de 320 nm.
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Viscosidad intrínseca y peso molecular viscosimétrico
La viscosidad intrínseca [] de los AX fue determinada mediante viscosimetría capilar con
temperatura controlada utilizando un capilar Ubbelohde mediante el método de Mead, Kraemer y
Fouss (Carvajal-Millan et al., 2007).
2.3 Gelificación de AX
La formación de geles de AX se llevó a cabo por el método enzimático (Fig. 1) utilizando
lacasa de Trametes versicolor (E.C.1.10.3.2) o peroxidasa de rábano (E.C.1.11.1.7). Se preparó una
dispersión de AX al 2% (p/v) en una solución reguladora de citrato-fosfato 0.5 M a pH 5. Los geles de
AX formados con lacasa se prepararon agregando 0.1 U de enzima por mg de AX, mientras que para
los geles inducidos con peroxidasa se añadió 0.1 U por mg de AX y 1.5 µmol de H2O2 por mg AX
(Martínez-López et al., 2019).
Figura 1. Esquema representativo que describe la gelificación de AX por vía enzimática.
Figure 1. Representative scheme describing the gelation of AX by the enzymatic route.
Fuente: Modificado a partir de Mendez-Encinas et al. (2019a).
Contenido de AF, di-AF y tri-AF en los geles
La cuantificación de AF, di-AF y tri-AF en los geles de AX se realizó mediante CLAR-FR
(Vansteenkiste et al., 2004). A 100 mg de gel previamente liofilizado (Freezone 6 Labconco, Kansas,
Missouri, EUA) por 24 h a −37 °C y 0.133 mbar se agregaron 10 mL de NaOH 2N. La muestra se
mantuvo en agitación (100 rpm, 2h, 25 °C) (KS 3000 ic control, IKA, NC, EUA) en atmósfera de
nitrógeno y ausencia de luz. La mezcla se neutralizó (1 mL de HCl 2N), se agregaron 5 mL de éter
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etílico, se centrifugó a 1000 g, 20 ˚C y 5 min, y el sobrenadante se recuperó en ausencia de luz. Se
agregó de nuevo 5 mL de éter etílico y se repitió la centrifugación y recuperación de sobrenadante.
Los sobrenadantes recuperados fueron evaporados a 35 ˚C bajo flujo de nitrógeno y el concentrado
se resuspendió en 1 mL de mezcla agua:metanol:ácido acético (60:30:10 v/v) y se filtró (0.45 µm,
Whatman, Maidstone, Reino Unido). Los filtrados se inyectaron en una columna Altima C18 (250mm
x 4.6 mm, Alltech Associates, Inc., Deerfield, EUA) en un equipo CLAR (Waters e2695 Separation
Module, Milford, EUA) acoplado un detector de arreglo de diodos (Waters 2998, Milford, EUA) a
una longitud de onda de 320 nm.
Reología
La cinética de formación de los geles de AX al 2% (p/v) fue estudiada mediante reología
dinámica oscilatoria de baja deformación utilizando un reómetro Discovery HR-2 (TA Instruments,
New Castle, EUA), de acuerdo con el procedimiento reportado por Vansteenkiste et al. (2004). El
módulo elástico (G´) y viscoso (G´´) se registró durante 1 h a 25 ˚C. Se utilizó una frecuencia de 1 Hz
y un porcentaje de deformación del 10%. Una vez formados los geles se les aplicó un barrido de
frecuencia de 1 a 10 Hz con 10% de deformación a 25 ˚C, así como un barrido de deformación de 0.1
a 25% a 1 Hz y 25 ˚C.
FT-IR de los geles
Se utilizó espectrometría infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) (Nicolet iS50 FT-IR,
Nicolet Instrument Corp., Madison, WI, EUA) utilizando reflectancia total atenuada (ATR), en modo
de absorbancia de 400-4000 cm-1 y 4 cm-1 de resolución, siguiendo el procedimiento reportado por De
Anda-Flores et al. (2020). Los geles analizados fueron previamente liofilizados (Freezone 6 Labconco,
Kansas, Missouri, EUA) por 24 h a −37 °C y 0.133 mbar.
2.4 Actividad Antioxidante de AX y geles de AX
La actividad antioxidante in vitro de AX y sus geles formados vía lacasa o peroxidasa fue
analizada utilizando los métodos ABTS+ y DPPH. La dispersión de AX se preparó en agua en el rango
de 0 a 5 mg/mL mediante agitación en placa durante 12 h a 25 °C. Para la evaluación de los geles
estos fueron liofilizados (Freezone 6 Labconco, Kansas, Missouri, EUA) por 24 h a −37 °C y 0.133
mbar. La dispersión de los geles liofilizados se preparó en agua a 5 mg/mL utilizando un
homogeneizador ultrasónico (JY92-IIDN, Hinotek, Shanghai, China) a 25 °C, 50 impulsos y 30% de
potencia durante 5 min. Se tomaron 400 µl de cada una de las dispersiones y se añadieron 350 µl de
metanol y se agitaron manualmente para su posterior análisis.
El método ABTS+ se utilizó de acuerdo con lo reportado anteriormente (Rosa et al., 2013; Re et al.,
1999). Se utilizaron dispersiones de AX a diferentes concentraciones (0-5 mg/mL). La absorbancia de
la muestra y la mezcla de reactivos ABTS+ se midieron a una longitud de onda de 734 nm en un
espectrofotómetro (Cary 60, Agilent, Santa Clara, EUA) a los 7, 15, 21 y 60 min. Los resultados se
reportaron como µmol de Trolox por gramo de muestra (µmol TEAC/g muestra). Se utilizó una curva
dosis-respuesta de Trolox de (1-20 µg/mL) para determinar la actividad antioxidante de las muestras.
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La actividad antioxidante por el método DPPH se midió de acuerdo con el método descrito por
Malunga y Beta (2015). Se utilizaron dispersiones de AX a diferentes concentraciones (0–2000 µg/mL).
Se preparó una solución de DPPH 45 µM (1.8 mg de DPPH en 30 mL de metanol). Posteriormente,
se añadieron 20 mL de agua y se almacenaron en la oscuridad hasta su uso. Se tomaron alícuotas de
400 µL de solución de AX y se mezclaron con 350 µL de metanol absoluto. Luego se añadieron 750
µL de solución DPPH a la mezcla, se agitaron y se mantuvieron en la oscuridad. Las mediciones se
realizaron a los 40 y 60 min a una absorbancia de 515 nm usando un espectrofotómetro (Cary 60,
Agilent, Santa Clara, EUA). La actividad antioxidante se calculó mediante una curva dosis-respuesta
de Trolox (0–15.0 µg/mL) y los resultados se expresaron como µmol de TEAC/g de muestra.
2.5 Análisis Estadístico
Los resultados fueron expresados como medias y desviación estándar de tres repeticiones.
Se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con nivel de significancia de 0.05 (p < 0.05), y
una comparación por Tukey-Kramer (Software NCSS versión 2021).
3. Resultados y discusión
3.1 Extracción y Caracterización de AX
El rendimiento de extracción de AX a partir de DDGS fue de 3.5%, siguiendo la metodología
de Carvajal-Millan et al. (2007). El polisacárido se obtuvo en forma de un polvo fino como se muestra
en la Fig. 2. El porcentaje de extracción con 2 h de hidrólisis alcalina fue mayor que lo reportado en
investigaciones previas con tiempos de 15, 30 y 60 min (De Anda-Flores et al., 2020; Marquez-
Escalante et al., 2019; Mendez-Encinas et al., 2018).
Las características macromoleculares de los AX obtenidos se presentan en el Tabla 1. Los AX
presentaron una proporción arabinosa/xilosa (A/X) de 0.60 ± 0.03, lo cual indica que la estructura del
polisacárido se encuentra moderadamente ramificada con arabinosas. El contenido de AF fue de
5.0 ± 0.4 (μg/g AX), menor al reportado en investigaciones previas con tiempos más cortos de
hidrólisis alcalina (De Anda-Flores et al., 2020; Mendez-Encinas et al., 2018). No fueron detectados di-
AF ni tri-AF en el polisacárido a diferencia de otras investigaciones, donde se ha reportado la
presencia de los di-AF 5-5´, 8-5´ y 8-O-4´ (Marquez-Escalante et al., 2019; Mendez-Encinas et al., 2019
a, b). Estas diferencias se pueden atribuir al tiempo más prolongado de hidrólisis alcalina (2 h) del
presente estudio, en comparación con tiempos más cortos (15, 30 y 60 min) utilizados en
investigaciones previas, ya que el grado de saponificación de los enlaces éster entre AF y arabinosas
es mayor al aumentar el tiempo de exposición a pH alcalino.
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Figura 2. AX extraídos de DDGS.
Figure 2. AX extracted from DDGS.
Tabla 1. Características macromoleculares de AX extraídos de DDGS.
Table 1. Macromolecular characteristics of AX extracted from DDGS.
Característica
Valor
Proporción A/X
0.60 + 0.03
Ácido ferúlico (µg/g AX)
5.0 + 0.4
di-AF (µg/g AX)
Nd
tri-AF (µg/g AX)
Nd
Viscosidad intrínseca [η] (mL/g)
114 + 13
Peso molecular viscosimétrico (Mv) kDa
368 + 35
Nd: no detectado. Valores medios de tres repeticiones ± desviación
estándar.
El espectro FT-IR de los AX se muestra en la Fig. 3 donde se observa una región característica para
este polisacárido entre 1200 y 800 cm-1. La banda principal centrada en 1035 cm–1 ha sido
anteriormente asignada a la flexión C-OH con un pequeño hombro 995 cm–1 relacionado con el
estiramiento C-O-C antisimétrico del enlace glucosídico β(1-4) de las xilosas que forman la cadena
principal de los AX (Barron y Rouau, 2008). La banda a 1720 cm–1 ha sido relacionada con el enlace
éster y con la vibración del enlace C=C como se ha reportado para el espectro infrarrojo del AF
(Kacurakova et al 1999). También se registró una banda en 3413 cm-1 correspondiente al estiramiento
de los grupos OH y en 2854 cm-1 asignada a los grupos CH2. Este espectro FT-IR es similar al
reportado por otros autores para AX (Mendez-Encinas et al. 2019a).
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Figura 3. Espectro infrarrojo con transformada de Fourier de AX obtenidos de DDGS.
Figure 3. Fourier transform infrared spectrum for AX from DDGS.
3.2 Gelificación de AX
FT-IR
El espectro FT-IR de los geles de AX (Fig. 4) es similar al de los AX no entrecruzados (Fig. 3)
con la región característica entre 1200 y 900 cm-1 y la banda de absorción máxima a 1035 cm-1
relacionada con los enlaces glicosídicos β‐(1‐4) de la cadena de xilosas en este polisacárido. Se observa
también la banda a 3413 cm-1 atribuida a los grupos OH y la de 2854 cm-1 asignada a los grupos CH2.
Por otro lado, los espectros de los geles de AX formados con lacasa y con peroxidasa presentaron
bandas mejor definidas y de mayor intensidad a 1573 cm-1 y 1414 cm-1 en relación con el espectro de
AX. Estas bandas han sido asociadas al estiramiento asimétrico del CO y relacionadas con un
aumento en la vibración de los grupos éster (Mendez-Encinas et al. 2019b). Estas diferencias se
atribuyen al acoplamiento oxidativo (vía lacasa o peroxidasa) entre las cadenas de polisacárido. Estos
espectros coinciden con los reportados por otros autores para AX gelificados (Mendez-Encinas et al.
2019 a, b; González-Estrada et al., 2015).
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Número de onda (cm-1)
1720
1035
3413
2854
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Figura 4. Espectro infrarrojo con transformada de Fourier de geles de AX inducidos con lacasa o peroxidasa.
Figure 4. Fourier transform infrared spectrum for AX gels induced with laccase or peroxidase.
Contenido de AF, di-AF y tri-AF
Después del proceso de gelificación de los AX, el AF se oxidó en un 94% al utilizar la enzima
lacasa o peroxidasa como agente entrecruzante. No se presentaron diferencias significativas respecto
al contenido de tri-AF en los geles de AX formados, pero aquellos inducidos con peroxidasa
presentaron un mayor contenido de di-AF respecto a los geles formados con lacasa (Tabla 2).
En el gel formado con lacasa se presentó el isómero 8-5´ como el di-AF mayoritario (61%), seguido
del di-AF 8-O-4´ (20%) y el di-AF 5-5´ (19%). En los geles formados con peroxidasa se presentaron
los isómeros de di-AF en el siguiente orden: 8-5´, 5-5´ y 8-O-4´ en un 59%, 25% y 16%,
respectivamente (Tabla 3). Estos resultados son similares a los reportados por Martínez-López et al.
(2019).
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Número de onda (cm-1)
Gel AX (lacasa)
Gel AX (peroxidasa)
1573
1414
1035
3413
2854
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Tabla 2. Contenido de AF, di-AF y tri-AF en AX y geles de AX inducidos con lacasa
o peroxidasa.
Table 2. Content of AF, di-AF and tri-AF in AX and AX gels induced with laccase or
peroxidase.
Muestra
AF
di-FA
tri-FA
(µg/g)
(µg/g)
(µg/g)
AX
5.00 ± 0.40 a
Nd
Nd
Gel AX (lacasa)
0.30 ± 0.03 b
0.153 ± 0.010 b
0.020 ± 0.001 a
Gel AX (peroxidasa)
0.31 ± 0.01 b
0.195 ± 0.010 a
0.020 ± 0.001 a
Nd: no detectado. Valores medios de tres repeticiones ± desviación estándar.
Letras distintas en una misma columna indican que la diferencia entre estas
medias es estadísticamente significativa.
Tabla 3. Composición de isómeros de di-FA en geles de AX.
Table 3. Composition of di-FA isomers in AX gels.
Muestra
8-5’
8-O-4’
5-5’
(µg/g)
(µg/g)
(µg/g)
Gel AX (lacasa)
0.093 ± 0.001 b
0.030 ± 0.001 a
0.030 ± 0.001 b
Gel AX (peroxidasa)
0.116 ± 0.001 a
0.032± 0.001 a
0.047± 0.001 a
Valores medios de tres repeticiones ± desviación estándar.
Letras distintas en una misma columna indican que la diferencia entre estas medias
es estadísticamente significativa.
Reología
Cinética de gelificación
La Fig. 5 muestra la evolución del módulo de elasticidad (G´) y el módulo de viscosidad (G´´)
de las soluciones de AX al 2 % (p/v) tratadas con lacasa o peroxidasa en función del tiempo. Para
ambos sistemas de gelificación se obtuvo un comportamiento similar con un incremento de G´ en
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función del tiempo hasta alcanzar un pseudo plateau. Al final de la cinética, los geles presentaron
valores de G´ y G´´ de 79 y 0.3 Pa para lacasa, respectivamente, mientras que para peroxidasa esos
valores fueron de 94 y 0.4 Pa, respectivamente. Estos valores están dentro del rango reportado para
otros geles de AX extraídos de DDGS (Mendez-Encinas et al., 2019a; Marquez-Escalante et al., 2019).
Las características viscoelásticas de los geles estudiados se resumen en la Tabla 4. Los valores bajos
de la tangente delta confirman que los materiales son predominantemente elásticos.
El mayor valor de G’ en geles formados con peroxidasa puede atribuirse al mayor contenido de di-
FA en este material (0.195 µg/g AX) respecto al obtenido al utilizar lacasa como entrecruzante (0.153
µg/g AX) como se describió en la Tabla 2. En relación con los isómeros de di-AF formados, en los
geles formados con peroxidasa fue más alta la proporción de estructuras 8-5’ y 5-5’. De acuerdo con
Hatfield y Ralph (1999), el di-AF 5-5’ es el único isómero relacionado con la formación de uniones
tanto inter como intra-cadena de AX. Los isómeros 8-5 y 8-O-4’ forman solamente uniones inter
cadena de AX. Así, los di-AF 8-5’ contribuyen de manera efectiva a la elasticidad a la red polimérica
del gel lo cual explica el mayor valor de G’ en estos geles formados con peroxidasa.
Las diferencias encontradas en las estructuras de entrecruzamiento y las características reológicas de
los geles de AX formados con lacasa o con peroxidasa podrían estar relacionados con los mecanismos
de acción de estas enzimas. La lacasa cataliza la oxidación de AF esterificado en el AX por la
interacción entre el O2 y el cobre presente en la enzima, lo que resulta en una reacción retardada. En
la catálisis con peroxidasa, el H2O2 actúa en la primera etapa de la reacción y, dado su menor peso
molecular, puede acceder más fácilmente al AF de los AX, favoreciendo así el acoplamiento oxidativo
entre las cadenas. Esto podría explicar el mayor contenido de di-AF en geles obtenidos con
peroxidasa respecto al generado con lacasa (Martínez-López et al., 2019).
Espectro mecánico y barrido de deformación en geles de AX
Los espectros mecánicos y barridos de deformación de los geles de AX formados por lacasa
o peroxidasa después de una hora a 25 °C se muestran en las Fig. 6 y 7. En estos gráficos se observa
un comportamiento típico de un material viscoelástico con valores de G´ lineales e independientes
de la frecuencia de deformación y valores de G´´ menores y dependientes de la frecuencia. Este
comportamiento es similar a lo reportado anteriormente para geles de AX inducidos por lacasa o
peroxidasa (Martínez-López et al., 2019). Los valores de tangente delta (G’’/G´) son menores a 1,
indicando la presencia de un sistema predominantemente elástico (Ross-Murphy, 1984). En las Tablas
4 y 5 se presentan las características viscoelásticas de los geles a 0.25 Hz y a 5% de deformación,
respectivamente, las cuales son las condiciones utilizadas en la cinética de gelificación (Fig. 5).
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Figura 5. Cinética de gelificación para soluciones de AX al 2% (p/v) inducida con lacasa o peroxidasa. Mediciones
a 0.25 Hz, 5% de deformación y 25 °C. Lacasa (G´▲, G´´ ); peroxidasa (G´ ●, G´´ ). Promedio de tres
repeticiones.
Figure 5. Gelation kinetics for 2% (w/v) AX solutions induced with laccase or peroxidase. Measurements at
0.25 Hz, 5% strain and 25 °C. Laccase (G'▲, G'' ); peroxidase (G´ ●, G´´ ). Average of three repetitions.
Tabla 4. Características viscoelásticas de geles de AX al 2% (p/v) inducidos con lacasa o peroxidasa al
final de la gelificación a 0.25 Hz y 5% de deformación.
Table 4. Viscoelastic characteristics of 2% (w/v) AX gels induced with laccase or peroxidase at the end
of gelation at 0.25 Hz and 5% strain.
Muestra
G´ (Pa)
G´´ (Pa)
Tangente delta
(G´´/G´)
Gel AX (lacasa)
79 + 7 b
0.30 + 0.03 b
0.003 + 0.001 a
Gel AX (peroxidasa)
94 + 5 a
0.41 + 0.01 a
0.004 + 0.002 a
Valores medios de tres repeticiones ± desviación estándar.
Letras distintas en la columna indican que la diferencia entre estas medias es estadísticamente
significativa.
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Figura 6. Barrido de frecuencia de geles de AX al 2% (p/v) entrecruzados vía lacasa o peroxidasa. Mediciones a
5% de deformación y 25 °C. Lacasa (G´▲, G´´ ); peroxidasa (G´ ●, G´´ ). Promedio de tres repeticiones.
Figure 6. Frequency sweep of 2% (w/v) AX gels crosslinked via laccase or peroxidase. Measurements at 5% strain
and 25 °C. Laccase (G'▲, G'' ); peroxidase (G´ ●, G´´ ). Average of three repetitions.
Tabla 5. Características viscoelásticas de geles de AX al 2% (p/v) inducidos con lacasa o
peroxidasa al final del barrido de frecuencia. Valores a 0.25 Hz en el barrido de frecuencia.
Table 5. Viscoelastic characteristics of 2% (w/v) AX gels induced with laccase or peroxidase at the
end of the frequency sweep. Values at 0.25 Hz in the frequency sweep.
Muestra
G´ (Pa)
G´´ (Pa)
Tangente delta G´´/G´)
Gel AX (lacasa)
85 + 6 b
0.32 + 0.05 a
0.003 + 0.001 a
Gel AX (peroxidasa)
98 + 6 a
0.45 + 0.08 a
0.004 + 0.001 a
Valores medios de tres repeticiones ± desviación estándar.
Letras distintas en la columna indican que la diferencia entre estas medias es estadísticamente
significativa.
0
1
10
100
1000
0.0 0.1 1.0 10.0
G' G´´ (Pa)
Frecuencia (Hz)
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Figura 7. Barrido de deformación en geles de AX al 2% (p/v) formados con lacasa o peroxidasa. Mediciones a
0.25 Hz y 25 °C. Lacasa (G´▲, G´´ ); peroxidasa (G´ ●, G´´ ). Promedio de tres repeticiones.
Figure 7. Deformation sweep for 2% (w/v) AX gels formed with laccase or peroxidase. Measurements at 0.25 Hz
and 25 °C. Laccase (G'▲, G'' ); peroxidase (G' ●, G''). Average of three repetitions.
Tabla 6. Características viscoelásticas de geles de AX al 2% (p/v) inducidos con lacasa o
peroxidasa. Valores a 5% en el barrido de deformación.
Table 6. Viscoelastic characteristics of 2% (w/v) AX gels induced with laccase or peroxidase.
Values at 5% in the deformation sweep.
Muestra
G´ (Pa)
G´´ (Pa)
Tangente delta G´´/G´)
Gel AX (lacasa)
85 + 6 b
1.4 + 0.1 b
0.015 + 0.001 b
Gel AX (peroxidasa)
99 + 6 a
1.9 + 0.1 a
0.019 + 0.001 a
Valores medios de tres repeticiones ± desviación estándar.
Letras distintas en la columna indican que la diferencia entre estas medias es estadísticamente
significativa.
0.1
1
10
100
1000
0.01 0.1 1 10
G´ G´´ (Pa)
Deformación (%)
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Actividad Antioxidante
La actividad antioxidante de los AX y los geles de AX inducidos con lacasa o peroxidasa,
determinada por el método ABTS+ y DPPH se presenta en el Tabla 7. Tanto al utilizar el método
ABTS+ como el método DPPH los AX y los AX gelificados presentaron actividad antioxidante. Los
valores registrados por el método ABTS+ fueron más altos que los obtenidos con el método DPPH.
Este efecto ya ha sido anteriormente reportado y se ha relacionado con una mayor afinidad del radical
fenoxilo hacia el radical ABTS+, ya que este radical es un catión inestable que reacciona con
antioxidantes generando compuestos que también poseen actividad antioxidante, lo que conduce a
la sobreestimación de los resultados obtenidos de actividad antioxidante en una muestra. Por el
contrario, el radical DPPH es relativamente estable y puede reducirse fácilmente extrayendo
hidrógeno de moléculas donantes (Marquez-Escalante et al., 2019). Los geles de AX inducidos con
peroxidasa como entrecruzante presentaron una actividad antioxidante mayor que los formados con
lacasa. Este resultado podría estar relacionado con el mayor contenido de di-AF en los geles formados
con peroxidasa, en particular de las estructuras isoméricas 8-5’ y 5-5´, lo cual concuerda con el reporte
de Jia et al. (2018), quien encontró que los di-AF 8-5’ y 5-5’ presentan mayor actividad antioxidante.
Tabla 7. Actividad antioxidante de AX y geles de AX inducidos por lacasa o peroxidasa.
Table 7. Antioxidant activity of AX and AX gels induced by laccase or peroxidase.
Muestra
ABTS+
(µmol de TEAC/g muestra)
DPPH
(µmolTEAC/g muestra)
AX
16.99 ± 0.37 a
4.2 + 0.1 a
Gel de AX (lacasa)
9.63 ± 0.07 c
3.0 + 0.1 c
Gel de AX (peroxidasa)
13.21 ± 0.28 b
3.3 + 0.1 b
TEAC= Actividad antioxidante equivalente a Trolox (µmol de TEAC/g muestra).
Valores promedios de tres repeticiones ± desviación estándar.
Letras distintas en la columna indican que la diferencia entre estas medias es estadísticamente
significativa.
4. Conclusiones
Los AX obtenidos de DDGS presentan características moleculares que les permiten formar
geles inducidos por lacasa y peroxidasa. Los geles obtenidos con peroxidasa presentan un mayor
contenido de estructuras de entrecruzamiento, así como un módulo elástico y una actividad
antioxidante más elevados respecto a los generados con lacasa. La diferencia en el contenido de di-
AF en los geles de AX formados con estas enzimas podría estar relacionada con el mecanismo de
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acción de las mismas. La mayor elasticidad de los geles formados con peroxidasa se atribuye al
contenido de di-AF en estos materiales mientras que el valor más alto de actividad antioxidante
podría relacionarse con la proporción más elevada de isómeros 8-5’ y 5-5´. Los resultados indican
que los AX desarrollan distinto contenido y formas de estructuras de entrecruzamiento, así como
diferentes características reológicas y propiedades antioxidantes en función del sistema enzimático
de gelificación utilizado. Bajo esta perspectiva, los resultados del presente estudio permiten plantear
la posibilidad de tratar los AX con distintos agentes entrecruzantes para diseñar materiales con
características y propiedades específicas para el área alimenticia, biomédica y farmacéutica, entre
otras.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Fondo de apoyo para el fomento de la investigación sobre la
región Sonora-Arizona en México 2019 (clave 20614, proyecto aprobado a E. Carvajal-Millan).
Conflicto de interés
Los autores señalan que no existe conflicto de intereses en la publicación de estos resultados.
Nomenclatura
AX Arabinoxilanos ferulados
DDGS Distillers Dried Grains with Solubles/Granos secos de destilería con solubles
AF Ácido ferúlico
di-AF Dímeros de ácido ferúlico
tri-AF Trímeros de ácido ferúlico
FT-IR Fourier Transform Infrared/Transformada de Fourier para infrarrojos
CLAR Cromatografía líquida de alta resolución
G´ Módulo elástico
G´´ Módulo viscoso
Pa Pascal
DPPH α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl
ABTS 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
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Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
TEAC Trolox-Equivalent Antioxidant Activity/Actividad antioxidante equivalente de
Trolox
ATR Attenuated Total Reflection/Reflectancia total atenuada
[] Viscosidad intrínseca
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2023 TECNOCIENCIA CHIHUAHUA
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